2011酶工程 第一章 酶的发酵生产.ppt

酶工程 第一章酶的发酵生产 第一章酶的发酵生产 第一节酶生产的概述第二节菌种选择第三节产酶菌体的发酵第四节产酶条件的优化第五节发酵产酶动力学 第一节酶生产的概述 按发酵方式分 可分为 液态发酵固态发酵固定化细胞发酵固定化原生质体发酵 几种酶生产方法的比较 提取 酶制剂工业的发展早期 酶多取自动植物原料 单动植物的生长周期长 同时还受地理 气候和季节等各种因素的限制 不适于大规模工业生产 几种酶生产方法的比较 化学合成 化学合成 包括酶的化学全合成和模拟酶的化学合成 酶的化学全合成1964年我国从氨基酸出发 以化学方法全合成了具有生物活性的胰岛素 1969年Gutte和Merrifield也通过化学法人工合成了具有活性的核糖核酸酶 现在已发展了一整套固相合成肽的自动化技术 2 模拟酶主 客体酶模型 环状糊精酶 胶束酶模型分子印迹酶模型 环状糊精酶 环糊精系列分布在空腔两侧的伯 仲羟基空腔周边的羟基 结合基团 与底物契合容易达到有利配置状态 通过化学方法引入催化基 建立电荷和质子传递体系 酶稳定性高 便宜 但催化专一性和活力差 胶束酶模型 胶束在水溶液中提供了疏水微环境 类似于酶的结合部位 可以对底物束缚 将催化基团如咪唑 硫醇 羟基和辅酶共价或非共价连接或吸附于胶束上 可使其成为具有酶活力的胶束模拟酶 印迹酶 当模板分子 印迹分子 与聚合物单体接触时会形成多重作用点 通过聚合过程这种作用就会被记忆下来 当模板分子除去后 聚合物中就形成了与模板分子空间构型相匹配的具有多重作用点的空穴 这样的空穴将对模板分子及其类似物具有选择识别特性 这是分子识别的基础 也是酶催化的基础 发酵生产酶的几种方式 固体培养发酵制成固体或半固体的麸曲 经过灭菌 冷却后 接种产酶微生物菌株 在一定条件下进行发酵 以获得所需的酶 适合霉菌的培养和发酵产酶 霉菌有菌丝 液态发酵结块 且固态发酵原料便宜 操作简单 但传递营养物质困难 产量相对少 液体深层发酵采用液体培养基 在生物反应器中 经灭菌 冷却后 接种产酶细胞 生产得到所需酶 酶的产率高 质量稳定 产品回收率高 是目前酶发酵的生产的主要方式 固定化细胞发酵把微生物固定在水不溶性的载体上 进行多批次连续或间歇发酵 这种发酵具有 细胞密度大 产酶能力高 发酵稳定性好 可反复使用或连续使用较长时间 固定化细胞流失较少 可在高稀释率条件下连续发酵 发酵液含菌体少 利于产品分离 额外成本高 须一定操作 微生物发酵方式的对比 1 液态发酵产酶 2 固态发酵 固态发酵和液态发酵的对比 3 固定化细胞发酵产酶固定化细胞颗粒很容易与发酵液分离 因此固定化细胞发酵生产胞外酶具有如下显著优点 发酵稳定性好 载体保护细胞 可在高稀释率条件下连续发酵 固定化细胞不容易流失 产品容易分离纯化 产物容易与固定化催化剂分离 缺点 异相催化的缺点 底物扩散受到载体的阻碍 不容易接近酶活性中心 克服了细胞膜传递底物带来的阻碍制备较复杂 酶解细胞壁 防止培养基高渗透压 防止细胞壁再生 4 固定化原生质体发酵 第二节菌种选择 基本要求 产酶量高 发酵周期短容易培养和管理 无培养基和发酵工艺的特殊要求菌种稳定行好 不易变异退化最好是产生胞外酶的菌种 利于分离对医药和食品用酶 还应考虑安全性 一细菌 1 大肠埃希氏杆菌 大肠杆菌的名声主要因它易于在实验室操作 生长迅速 而且营养要求低 应用 大肠杆菌能作为宿主供大量的细菌病毒生长繁殖大肠杆菌也是最早用作基因工程的宿主菌工业上生产谷氨酸脱羧酶 天冬酰胺酶生产基因工程工具酶 2 枯草芽孢杆菌 Bacillussubtilis 枯草芽孢杆菌是工业发酵的重要菌种之一 生产淀粉酶 蛋白酶5 核苷酸酶 某些氨基酸及核苷 水处理的聚合氨基酸 二放线菌 放线菌因菌落呈放线状而的得名 它是一个原核生物类群 在自然界中分布很广 主要以孢子繁殖 放线菌与人类的生产和生活关系极为密切 目前广泛应用的抗生素约70 是各种放线菌所产生 一些种类的放线菌还能产生各种酶制剂 蛋白酶 淀粉酶 和纤维素酶等 生产葡萄糖异构酶主要菌株 由于生产抗生素 有不少能对抗生素修饰的酶种 如青霉素酰化酶 16a 羟基化酶 三霉菌 1 曲霉 Aspergillus 应用 是制酱 酿酒 制醋的主要菌种 农业上用作生产糖化饲料的菌种 因此是生产酶制剂 蛋白酶 淀粉酶 果胶酶 的菌种 生产有机酸 如柠檬酸 葡萄糖酸等 2 根霉 Rhizopus 代表种 米根霉 根霉能产生一些酶类 如淀粉酶 果胶酶 脂肪酶等 是生产这些酶类的菌种 在酿酒工业上常用做糖化菌 11a羟化酶有些根霉还能产生乳酸 延胡索酸等有机酸 3 木霉 Trichoderma 木霉属于半知菌纲 生长时菌落呈棉絮状或致密丛束状 菌落表面呈不同程度的绿色 木霉是生产纤维素酶的重要菌株 木霉产生的纤维素酶中包含有Cl酶 Cx酶和纤维二糖酶等 此外 木霉中含有较强的l7 羟化酶 常用于甾体转化 四酵母 1 啤酒酵母主要用于酿造啤酒 酒精 饮料酒和面包制造 在酶的生产方面 用于转化酶 丙酮酸脱羧酶 醇脱氢酶等的生产 氧化还原酶 脱氢酶广泛应用与轻工业 如香料苯乙醇就是以苯乙酮为原料由脱氢酶催化得到 2 假丝酵母主要生产脂肪酶 南极假丝酵母 褶皱假丝酵母 尿酸酶 醇脱氢酶17a羟化酶 第三节产酶菌体的发酵 各种生物对营养的需求 五大要素 碳源 氮源 无机盐 生长因子 水 一培养基 1 构成细胞物质或代谢产物中碳架 2 碳源可作能源 为生命活动提供能量 常用碳源 糖类 醇类 脂类 有机酸 烃类 蛋白质及其降解物 异养微生物 糖类是最好碳源 葡萄糖最为通用 水是微生物最基本的组成分 1 水是细胞质组分 直接参与各种代谢活动 2 水是微生物体内和体外的溶剂 吸收营养成分和代谢废物 3 调节细胞温度和保持环境温度的稳定 比热高 传热快 水 碳源 选择合适碳源 以适应目的酶的合成调节机制 构成细胞物质和代谢产物中氮素 不能用作能源 氮源 有机氮源 蛋白胨 酵母膏 牛肉膏 无机氮源 铵盐 硝酸盐 1 参与酶的组成 构成酶活性基 激活酶活性 2 维持细胞结构的稳定性 3 调节细胞渗透压 4 控制细胞的氧化还原电位 5 有时可作某些微生物生长的能源物质 氮源 无机盐 需要注意合适的碳氮比 碳源代谢产物酸性 氮源代谢产物碱性 配比不当会造成培养基酸化或者碱性化 不适宜菌体生长 生长因子 生长因子是指某些微生物不能用普通的碳源 氮源物质进行合成 而必须另外加入少量的生长需求的有机物质 分类 化学结构分成维生素 氨基酸 嘌呤 或嘧啶 及其衍生物和类脂成分等四类 功能 以辅酶与辅基的形式参与代谢中的酶促反应 实验室中常用酵母膏 蛋白胨 牛肉膏等作为各种生长因子的的需要 麦芽汁 米曲汁等天然培养基中本身含有各种生长因子 实验室的常用培养基 细菌 牛肉膏蛋白胨培养基 或简称普通肉汤培养基 放线菌 高氏1号合成培养基培养 酵母菌 麦芽汁培养基 霉菌 查氏合成培养基 同一菌 由于培养目的不同 使用不同 例如枯草芽孢杆菌 一般培养 肉汤培养基或LB培养基 自然转化 基础培养基 观察芽孢 生孢子培养基 产蛋白酶 以玉米粉 黄豆饼粉为主的产酶培养基 第三节产酶菌体的发酵 培养基 的pH必须控制在一定的范围内 以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物 为了维持培养基pH的相对恒定 通常在培养基中加入pH缓冲剂 或在进行工业发酵时补加酸 碱 细菌与放线菌 pH7 7 5酵母菌和霉菌 pH4 5 6范围内生长 1 pH值的控制 细胞发酵产酶的最适pH值与生长最适pH值往往有所不同 细胞生产某种酶的最适pH值通常接近于该酶催化反应的最适pH值 有些细胞可以同时产生若干种酶 在生产过程中 通过控制培养基的pH值 往往可以改变各种酶之间的产量比例 二发酵条件及控制 通常在生物学范围内每升高10 生长速度就加快一倍 所以温度直接影响酶反应 对于微生物来说 温度直接影响其生长和合成酶 2 温度的控制 枯草杆菌的最适生长温度为34 37 黑曲霉的最适生长温度为28 32 细胞发酵产酶的最适温度与最适生长温度有所不同 而月往往低于最适生长温度 这是由于在较低的温度条件下 可提高酶的稳定性 延长细胞产酶时间 在较低的温度条件下 可以提高酶所对应的mRNA的稳定性 增加酶生物合成的延续时间 从而提高酶的产量 在细胞生长和发酵产酶过得中 由于细胞的新陈代谢作用 不断放出热量 会使培养基的温度升高 同时 热量不断扩散和散失 又会使培养基温度降低 两者综合 决定了培养基的温度温度控制的方法一般采用热水升温 冷水降温 故此在发酵罐中 均设计有足够传热面积的热交换装置 如排管 蛇管 夹套 喷淋管等 培养基中的能源物质 一般是碳源提供 必须经有氧降解才能产生大量的ATP 为此 必须供给充足的氧气 在培养基中生长和发酵产酶的细胞 一般只能利用溶解在培养基中的氧气 溶解氧 由于氧是难溶于水的气体 培养基中含有的溶解氧并不多 很快就会被细胞利用完 为此 必须在发酵过程中连续不断地供给无菌空气 使培养基中的溶解氧保持在一定水平 以满足细胞生长和产酶的需要 3 溶解氧的控制 3 溶解氧的控制 一般说来 通气量越大 氧气分压越高 气液接触时间越长 气液接触面积越大 则溶氧速率越大 培养液的性质 主要是黏度 气泡 以及温度等对于溶氧速率有明显影响 调节通气量调节氧的分压调节气液接触时间调节气液接触面积改变培养液的性质 控制溶氧 稳态扩散下单位时间内通过垂直于扩散方向的单位截面积的扩散物质流量 扩散通量 与该面积处的浓度梯度成正比即J D dc dx 其中D 扩散系数 cm2 s J 扩散通量 g cm2 s 式中负号表明扩散通量的方向与浓度梯度方向相反 4 消泡泡沫存在影响液体性质 主要影响溶氧上控制泡沫的方式目前通常采用化学和机械两种方法 1 化学消泡剂必需满足以下条件 消泡剂对气 液界面的分散系数足够大 容易取代发酵液中的表面活性物质分布在气液两相界面上 但不形成气泡 消泡作用迅速有效 化学性质稳定 在水中的溶解度小 以保持持久的消泡或抑泡性能 不与次生产物起任何化学反应 不影响产物的提取和产品质量 对植物细胞无毒害 不影响气体在营养液中的传递和溶解 来源方便 价格便宜 2 机械消泡是靠机械装置实现的 其优点是勿需在培养液中加入其它物质 从而减少了由于消泡剂所引起的污染和对后续分离工艺的影响 但机械消泡效果常不如化学消泡迅速彻底 同时机械消泡也会增加培养装置的复杂性 第四节产酶条件的优化 酶合成调节结构的作用是生物机体将体内的合成原料与能量最经济有效地用于合成生命最需要的物质的保证 但从应用的目的出发 则应打破这种调节控制 以其使某些酶的产量大幅度地提高 现已报道 在采取相应的措施后 其产量可有上千倍的变化 机理上讲 还是控制了酶蛋白的表达水平 酶和其他蛋白质一样 其合成可在复制 转录和翻译等各种水平上进行调节控制 对于原核生物 由于其转录和翻译过程紧密关联 因此 只要控制转录 也就可控制酶的合成 其调控机制普遍接受的是操纵子模型 相关调制机理见基础部分 1 添加诱导物 对于诱导酶的发酵生产 在发酵过程中的某个适宜的时机 添加适宜的诱导物 可以显著提高酶的产量 例如 乳糖诱导 半乳糖苷酶 纤维二糖诱导纤维素酶 蔗糖甘油单棕榈酸诱导蔗糖酶的生物合成等 诱导物一般可以分为3类1 酶的作用底物2 酶的催化反应产物3 作用底物的类似物 一般不随着菌生长而产生浓度变化 因此效果好 但要注意其对菌的化学毒性 诱导 2 控制阻遏物的浓度 1 产物阻遏作用是由酶催化作用的产物或者代谢途径的末端产物引起的阻遏作用 对于受代谢途径末端产物阻遏的酶 可以通过控制末端产物的浓度的方法使阻遏解除 移去 少加 在培养基中添加抑制剂抑制尾产物形成的其它相关酶类去阻止尾产物形成的采用营养缺陷型突变菌株 调控基因 操纵基因突变 该菌种酶不再受该产物阻遏 通常用类似结构底物培养法 阻遏 为了减少或者解除分解代谢物阻遏作用 应当控制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源的浓度 防止分解代谢物过多而积累 采用其他较难利用的碳源 如淀粉等 采用补料 分次流加碳源 添加一定量的环腺苷酸 cAMP 2 控制阻遏物的浓度 2 分解代谢物阻遏作用是由分解代谢物 葡萄糖等和其它容易利用的碳源等物质经过分解代谢而产生的物质 引起的阻遏作用 代谢物阻遏 R LacZ LacY Laca mRNA CAP基因 结构基因 T CGP CAP O CAP结合部位 RNA聚合酶 T cAMP CAP P CGP 降解物基因活化蛋白 catabolicgeneactivationprotein CAP 环腺苷酸受体蛋白 cycilicAMPreceptorprotein 使CAP呈失活状态 帮助聚合酶结合 产酶促进剂是指可以促进产酶 但是作用机理未阐明清楚的物质 产酶促进剂对不同细胞 不同酶的作用效果各不相同 现在还没有规律可循 要通过试验确定所添加的产酶促进剂的种类和浓度 例如 添加一定量的植酸钙镁 可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的产量提高1 20倍 添加聚乙烯醇 Polyvinylalcohol 可以提高糖化酶的产量 4 添加产酶促进剂 第五节发酵产酶动力学 酶生物合成的模式 酶生产过程中细胞生长动力学 酶生产过程中产酶动力学 Go Go Go 酶生产过程中底物消耗动力学 Go 细胞在一定条件下培养生长 其生长过程一般经历调整期 生长期 平衡期和衰退期等4个阶段 通过分析比较细胞生长与酶产生的关系 可以把酶生物合成的模式分为4种类型 即同步合成型 延续合成型 中期合成型和滞后合成型 一酶生物合成的模式 同步合成型 酶的生物合成与细胞生长同步进行的一种酶生物合成模式 该类型酶的生物合成速度与细胞生长速度紧密联系 又称为生长偶联型 属于该合成型的酶 其生物合成伴随着细胞的生长而开始 在细胞进入旺盛生长期时 酶大量生成 当细胞生长进入平衡期后 酶的合成随着停止 大部分组成酶的生物合成属于同步合成型 有部分诱导酶也按照此种模式进行生物合成 细胞浓度mg ml 酶浓度U ml 延续合成型 酶的生物合成在细胞的生长阶段开始 在细胞生长进入平衡期后 酶还可以延续合成一段较长时间 属于该类型的酶可以是组成酶 也可以是诱导酶 例如 在黑曲霉在以半乳糖醛酸或果胶为单一碳源的培养基中培养 可以诱导聚半乳糖醛酸酶 中期合成型 该类型的酶在细胞生长一段时间以后才开始 而在细胞生长进入平衡期以后 酶的生物合成也随着停止 例如 枯草杆菌碱性磷酸酶 Alkalinephophatase EC3 1 3 1 的生物合成模式属于中期合成型 这是由于该酶的合成受到其反应产物无机磷酸的反馈阻遏 而磷又是细胞生长所必不可缺的营养物质 培养基中必须有磷的存在 这样 在细胞生长的开始阶段 培养基中的磷阻遏碱性磷酸酶的合成 只有当细胞生长一段时间 培养基中的磷几乎被细胞用完 低于0 01mmol L 以后 该酶才开始大量生成 又由于碱性磷酸酶所对应的mRNA不稳定 其寿命只有30min左右 所以当细胞进入平衡期后 酶的生物合成随着停止 细胞浓度mg ml 酶浓度U ml 滞后合成型 此类型酶是在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物合成并大量积累 又称为非生长偶联型 许多水解酶的生物合成都属于这一类型 属于滞后合成型的酶 之所以要在细胞生长一段时间甚至进入平衡期以后才开始合成 主要原因是由于受到培养基中存在的阻遏物的阻遏作用 只有随着细胞的生长 阻遏物几乎被细胞用完而使阻遏解除后 酶才开始大量合成 若培养基中不存在阻遏物 该酶的合成可以转为延续合成型 该类型酶所对应的mRNA稳定性很好 可以在细胞生长进入平衡期后的相当长的一段时间内 继续进行酶的生物合成 黑曲霉羧基蛋白酶生物合成 放线菌素D对产酶的影响 细胞浓度mg ml 酶浓度U ml 酶浓度U ml 酶浓度U ml 30 22 不加 加入 不加 加入 理想的酶合成模式 酶所对应的mRNA的稳定性以及培养基中阻遏物的存在是影响酶生物合成模式的主要因素 其中 mRNA稳定性好的 可以在细胞生长进入平衡期以后 继续合成其所对应的酶 mRNA稳定性差的 就随着细胞生长进入平衡期而停止酶的生物合成 不受培养基中存在的某些物质阻遏的 可以伴随着细胞生长而开始酶的合成 受到培养基中某些物质阻遏的 则要在细胞生长一段时间甚至在平衡期后 酶才开始合成并大量积累 在酶的发酵生产中 为了提高产酶率和缩短发酵周期 最理想的合成模式应是延续合成型 因为属于延续合成型的酶 在发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别 细胞一开始生长就有酶产生 直至细胞生长进入平衡期以后 酶还可以继续合成一段较长的时间 对于同步合成型的酶 要尽量提高其对应的mRNA的稳定性 为此适当降低发酵温度是可取的措施 对于滞后合成型的酶 要设法降低培养基中阻遏物的浓度 尽量减少甚至解除产物阻遏或分解代谢物阻遏作用