气相色谱法测定厌氧发酵液中挥发性脂肪酸的研究.docx

文章编号: 1000 2340( 2013) 05 0584 03气相色谱法测定厌氧发酵液中挥发性脂肪酸的研究赵兴涛，徐桂转，刘杰博，陈芮芮( 河南农业大学机电工程学院，农业部可再生能源重点开放试验室 ，河南 郑州 450002)摘要: 为了测试厌氧发酵液中挥发性脂肪酸的含量，配制了不同质量浓度的乙酸、丙酸、丁酸标准溶液，利用毛细管柱，建立了相应的气相色 谱 程 序 升 温 测 定 方 法 结 果 表 明，利用该分析方法得到 3 种酸的出峰时间分别为 20 395，22 217，23 921 min，3 种挥发性脂肪酸能够很好地分离 根据标准溶液绘制的 3 种酸的回归曲线线性相 关系数均大于 0 999 验证性试验得到乙酸、丙酸、丁酸的回收率分别为 96 72% ，97 20% ，97 13% ，说明在试验 条件下，气相色谱法能准确地测量 3 种酸在厌氧发酵液中的含量关键词: 挥发性脂肪酸; 毛细管柱; 气相色谱; 厌氧发酵中图分类号: S216文献标志码: AStudy on VFAs content in the anaerobic fermentationliquid by gas chromatographyZHAO Xing-tao，XU Gui-zhuan，LIU Jie-bo，CHEN ui-rui( Mechanical and Electrical Engineering College of Henan Agricultural University，Key Laboratory of enewable Energy of Ministry of Agriculture，Zhengzhou 450002，China)Abstract: In order to analysis the contents of VFAs in the anaerobic fermentation liquid，different con-centrations of acetic acid，propionic acid，butyric acid were prepared The programmed temperature method using capillary column to determine the contents of VFAs on gas chromatograph ( GC) was set up The results were shown that the peak time of three VFAs is 20 395，22 217 and 3 921min respec- tively，which can be divided by GC well The correlation coefficient of the regression curve of the standard solutions are all larger than 0 999，and the recovery of confirmatory experiments of three VFAs are 96 72% ，97 20% ，97 13% respectively，which shows that the three VFAs in the anaerobic fermentation liquid can be determined accuratly by the GC method of this studyKey words: VFAs; capillary column ; gas chromatography; anaerobic fermentation在秸秆的厌氧发酵过程中，根据有机物降解的特点可把厌氧反应过程分解为水解产酸阶段和产 甲烷阶段1 4 水解产酸阶段主要是微生物把高分 子有机物分解为各种挥发性脂肪酸的过程，挥发性 脂肪酸主要有乙酸、丙 酸、丁 酸 等 在 甲 烷 化 过 程 中，挥发性脂肪酸被甲烷化细菌在中性或微碱性环 境中转化为甲烷和二氧化碳 因此，厌氧发酵的成功与否主要决定于酸化程度 ( 挥发性脂肪酸的产 生量) 和甲烷菌工作情况 一 方 面，甲 烷 菌 利 用 酸 化过程中产生的挥发性脂肪酸来形成甲烷，但高浓 度的挥发性酸形成的强酸性环境往往会抑制甲烷 菌的活性，使其不能很好利用挥发性脂肪酸产生甲 烷，甚至会导致整个厌氧反应装置失 活5; 其 次， 在酸化过程中对挥发性脂肪酸的检测可以很好地收稿日期: 2013 02 11基金项目: 农业部引进国际先进农业科学技术计划项目( 2011 515)作者简介: 赵兴涛，1973 年生，男，河南平顶山人，博士研究生，主要从事可再生能源利用与转换技术研究通讯作者: 徐桂转，1972 年生，女，山西侯马人，副教授，博士第 5 期赵兴涛等: 气相色谱法测定厌氧发酵液中挥发性脂肪酸的研究585了解有机物的降解过程，同时反映出甲烷菌的活跃程度，进而得出厌氧反应器的运行情况，所以，在厌 氧消化中，挥 发 性脂肪酸是一个很重要的监测指 标6 目前，测定挥发性脂肪酸的方法主要有比色 法、纸 色 谱 法、柱 色 谱 法、滴定法以及气相色谱法 等7，8 其中，比色法只能测定单种酸，工作量大且 精度较低; 纸色谱法和柱色谱法试剂用量大，准确 度稍差; 滴定法测定的主要是混合酸总量，不能分 析出单种酸的含量 气相色谱法已成功用于挥发性 脂肪酸的 分 析9 11，但目前多数方法中样 品 制 备 较为繁琐、测试时间较长12 15 本研究用不同质量 浓度的乙酸、丙酸、丁酸标准溶液，利用毛细管柱， 采用程序升温的方法，得到 3 种挥发性脂肪酸酸的 标准曲线、保留时间以及回归线方程 以得到高精 度的、快速的脂肪酸测试方法 从而为利用气相色 谱法测试挥发性脂肪酸提供一种样品制备简便、测 试快速的方法瓶中，加入 450 mL 沼液和 1 000 mL 蒸馏水，在 35 培养箱中厌氧发酵 48 h 取 1 5 mL 发酵液于 2 mL 离心管中，在离心机中以 5 000 r min 1 离 心15 min，用微量进样器取 1 L 上清液注入气相色 谱仪，采用程序升温的方法进行分析回收率 准确量取 190 6 L 乙酸，201 41 5 2L 丙酸，208 6 L 丁酸，配制成 2 gL 1 的混合标准溶液，用微量进样器取 1 L 注入气相色谱仪 分析22 1结果与分析定性分析进样: 分别用微量进样器取 1 L 配制好的不同质量浓度的乙酸、丙酸、丁酸标准溶液，注入气相色谱仪中，得到 3 种酸的气相色谱图( 图 1 图 3) 1材料与方法1 1 材料1 乙酸、丙酸、丁酸均为分析纯，本试验使用试 剂均为色谱纯，购于郑州药剂公司1 2 试验仪器与设备气相色 谱 仪 ( Aligent6820 美 国 安 捷 伦 公 司) ， 低噪音空气泵( SGK 2LB) 、高纯氢发生器( SGH 300) 均购于北京东方精华苑科 技 有 限 公 司，高 速 台式离心机( TCL 16C) ，上海安亭科学仪器厂1 3色谱条件毛细 管 柱 ( DB FFAP，30m 0 323 mm 1 00 m) ; 柱压: 0 05 MPa; 柱 温: 程 序 升 温，初 始温度 60 ，以 4 min 1 速率升至 100 ，保持 5 min; 进样器温度: 200 ; 检测器温度: 250 ; 载气 为氮气，流 量: 30 mL min 1 ; 高纯氢发生器流速 30 mLmin 1 ; 分流 进 样 方 式; 分 流 比 1 30; 进 样 量 1 L标准品处理本试验采用单因素分析方法，分 别 准 确 量 取953 L 乙酸，1 007 L 丙酸，1 043 L 丁酸置于 3 个 1 000 mL 容量瓶中，用蒸馏水定容，依次配制成 质量浓度为 10 g L 1 的 乙 酸，丙 酸，丁 酸 标 准 溶 液，然后准确量取不同体积的各种标准溶液，分别 配制 0 05，0 1，0 3，0 5，0 7，1，2，3，4，5 g L 13 种酸不同质量浓度梯度的标准溶液1 5 验证试验样品的处理1 5 1 定性验证 取 100 g 风干玉米秸秆于发酵1 4由图 1 图 3 可以看出，乙酸，丙酸，丁酸的出峰时间分别为 20 395，22 217，23 921 min 说明利 用 DB-FFAP 毛细管柱，在该分析条件下，气相色谱586河 南 农 业大 学 学 报第 47 卷可以将 3 种酸很好地分离开来 结果表明，可以利用气相色谱方法分离并定量分析 3 种挥发性脂肪 酸在溶液中的含量表 2 挥发性脂肪酸的含量 Table 2 The content of VFAs 测试质量浓度/ ( gL 1 )Test平均质量浓度/ ( gL 1 )Mean样品Samples保留时间 / minPeak time2 2标准曲线测定利用气相色谱分析，得出 3 种挥发性脂肪酸在 concentration concentration 20 39520 42320 41522 22822 23922 23823 95623 93524 0651 2511 2021 2740 7290 7400 7310 9780 9550 958各自保留时间内出峰的峰面积 以峰面积 y 对质量浓度 x 绘制标准曲线( 图 4) 乙酸Acetic acid1 242丙酸Propionic acid0 733丁酸Butyric acid0 9642 3 2 回收率 分别取配制好的 2 gL 1 乙酸、丙酸、丁酸混合标准溶液，进行气相色谱分析，共测 定 3 次，然后利用得到的回归线方程，计算出 3 种 酸的测定浓度和回收率，如表 3 所示 从表 3 可以 看出，测出的 3 种挥发性脂肪酸的含量接近标准 值，乙 酸，丙 酸，丁酸的回收率分别为 96 72% ，97 20% ，97 13% ，精确度高图 4 挥发性脂肪酸的标准曲线Fig 4 The standard curve of VFAs从图 4 可以看出，在本试验质量浓度范围内，乙酸、丙酸、丁酸的峰面积与其质量浓度呈良好线 性关系 根据标准曲线，得出 3 种酸的回归方程及 相关系数( 表 1) 表 3 挥发性脂肪酸的回收率Table 3 The recovery rate of VFAs样品Samples测试质量浓度 / ( gL 1 )Test concentration回收率 / %ecovery平均值 / %Mean value表 1 挥发性脂肪酸的回归线方程 Table 1 The regression equation of VFAs 1 9231 9391 9411 9541 9461 9341 9391 9431 94696 1596 9597 0597 7097 3096 7096 9597 1597 30乙酸Acetic acid96 72样品回归曲线相关系数Samples egression curve Correlation coefficient 丙酸Propionic acid97 20乙酸Acetic acid丙酸Propionic acid丁酸Butyric acidy = 2 282 132 2x 89 797 40 999 7y = 3 539 649 0x 117 384 10 999 3丁酸Butyric acid97 13y = 3 269 443 0x + 57 051 30 999 6试验结果说明，本试验方法可以很精确测出发酵液中主要挥发性酸的含量，方法操作简便、准确 度高，所测结果与理论值符合程度高，可以用来计 算厌氧消化器中挥发性脂肪酸的含量，反映甲烷菌 的活跃 程度以及监测 整个厌氧反应装置的运行 情况线性相关系数越接近 1，表明标准曲线的线性拟合度越高，结果越精确 从表 1 可以看出，使用毛 细管柱，采用程序升温方法得到的 3 种挥发性脂肪酸的标准曲线的线性相关系数均在 0 999 以上，利用此曲线分析和计算厌氧发酵液中挥发性脂肪酸 的含量较为准确，下面的试验将对该检测方法进行 验证2 3 验证分析2 3 1 定性验证 按照上述方法对风干玉米秸秆 进行发酵处理 48 h，然后对发酵液进行气相色谱分 析，共测定 3 次，并利用上述试验得出的回归线方 程进行计算，结果见 表 2 从 表 2 可 以 看 出，丙 酸， 丁酸的测试质量浓度分别为 1 242 ，0 733 ，0 964gL 1 3结语本研究建立了毛细管柱气相色谱检测厌氧发酵液中挥发性脂肪酸定性以及定量的的方法 采用毛细管柱，利用程序升温方法能够将挥发性脂肪酸 乙酸、丙酸和丁酸很好地分离开来 3 种 酸 的 标 准 液质量浓度最小为 0 05 gL 1 ，最大为 5 gL 1 ， 该质量浓度范围涵盖了厌氧发酵液中挥发性脂肪( 下转第 591 页)第 5 期冯 冲等: 白蚁肠道内纤维素酶产生菌的分离与鉴定5913张丽青，吴海龙，姜红霞，等 纤维素降解细菌的筛选及其 产 酶 条 件 优 化J 环境科学与管 理，2007，32( 10) : 110 117顿宝庆，吴 薇，王旭静，等 一株高纤维素酶活力纤 维素分解菌的分离与鉴定J 中国农业科技导报，2008，10( 1) : 113 117AZUMA J，NAKASHIMA K Distribution and properties of endo-1，4-glucanase from a lower termite，Coptote- rmes Formosanus( Shiraki) J Biosci Biotechnol Bio-chem，2000，64: 1500 1506郭成栓，崔堂兵，郭 勇 1，4 葡聚糖内切酶基因的克隆及表达J 华南理工大学学报: 自然科学版，2008( 12) : 112 115沈雪亮，夏黎明 产纤维素酶细菌的筛选及酶学特性 研究J 林产化学与工业，2002，22( 1) : 47 48张 虹 纤维素酶产生菌的分离和鉴定J 齐齐哈 尔师范学院学报: 自然科学版，1997，17( 4) : 62 高建民，翁海波，席 宇，等 一株嗜热嗜酸纤维素酶 高产霉菌分离鉴定及其酶学性质研 究J 微 生 物 学通报，2007，34( 4) : 715? 718( 责任编辑: 朱秀英)748596( 上接第 586 页)酸的质量浓度范围，根据标准液绘制的标准曲线回 归线性相关系数均大于 0 999，说明定量分析精度 较高 通过验证试验表明，乙酸，丙酸，丁酸的回收 率分别为 96 72% ，97 2% 和 97 13% ，回收精度较 高，说明利用本研究建立的气相色谱分析方法能够 较为精确地定量分析挥发性脂肪酸的质量浓度 本 研究建立的挥发性脂肪酸分析方法操作简单，测试 精度较高，可以用来定量分析厌氧消化器中挥发性 脂肪酸的含量，从而反映甲烷菌的活跃程度及监测 整个厌氧反应装置的运行情况7JAOSLAV J，STANSKA E，FANCISCI E P，et alBlood cultures evaluation by gas chromatography of vola- tile fatty acidsJ Med Sci Monit，2000，6: 605 610 SULLIVAN H M，MATIN S A Effects of a Saccharom vces cerevisiae Culture on in vitro Mixture umen Mi- croorganism Fermentation J Dairy Sci，1999，82:2011 2016任晓鸣，陆 烽，王 蔚，等 利用气相色谱测定剩余 污泥厌氧消化产生的混合 VFAJ 环 境 科 技，2009( 增刊) : 39 418910 黄晓兰，陈云华 发酵液中酸性物质的气