第4讲 酶的合成调节.doc

酶活力：l 也称酶活性，酶催化一定化学反应的能力。l 酶活力大小可用在一定条件下，它所催化的某一化学反应的起始速率V0表示，即用反应起始阶段产物增加(或底物减少)的速率表示。二、酶活力单位国际单位：l 1961年国际生物化学与分子生物学联合会规定：在特定条件下，每 1 min 催化1 mol 的底物转化为产物的酶量定义为1 个酶活力单位。这个单位称为国际单位（IU）l 国际上另一个常用的酶活力单位是卡特（Kat）。在特定条件下，每秒催化1 mol底物转化为产物的酶量定义为1卡特（Kat）。l 1Kat = ？ IU l 1IU = ？nKat酶的比活力l 酶的比活力是酶纯度的一个指标，是指在特定条件下，单位重量（mg）蛋白质或RNA所具有的酶活力单位数。 l 酶活力：样品中酶总共有多少个酶单位。l 比活力：每mg蛋白质中有多少个酶单位。 酶比活力酶活力（单位）/ mg （蛋白或RNA） 可用以比较每单位质量酶蛋白的催化能力。l 对同一种酶，比活力可以代表酶的纯度，比活力愈高，表示酶愈纯。在酶纯化过程中，比活力增高。l 例：13克酶粉溶于100毫升水中制成酶液，取该酶液5毫升与45毫升浓度为4mol/L的底物溶液混合，20分钟后混合溶液中底物的浓度为1mol/L，计算该酶粉1个酶活力单位相当于多少mg酶粉？该酶粉的酶比活力是多少？l 答案：1 IU = 0.1mg，该酶粉的酶比活力为10 IU/mg三、酶的转换数与催化周期l 酶的转换数（Kp），又称为摩尔催化活性（molar catalytic activity ），是指每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数。即是每摩尔酶每分钟催化底物转化为产物的摩尔数。l Kp是酶催化效率的一个指标。通常用每微摩尔酶的酶活力单位数表示。单位为 min-1 l 转换数的倒数称为酶的催化周期。催化周期是指酶进行一次催化所需的时间。单位为毫秒（m sec）或微秒（sec）。 酶活力的国际单位无法律效力l 实际应用中及商品酶制剂中，酶单位的定义较乱，要注意：l 酶活力单位的定义和测定系统条件。l 生产上多使用： 在（）条件下，每（s、min、h）催化（umol、g、mg）底物产生（1umol、mg、ug）产物所需要的酶量。l 中温-淀粉酶（GB8275-2009） ：1g固体酶粉(或1 mL液体酶)，于60、pH=6.0条件下，1h液化1g可溶性淀粉所需的酶量，即为1个酶活力单位，以u/g(u/mL)表示。 可溶性淀粉（湖州展望化学药业有限公司）例如：l 木聚糖酶： 某公司定义：在50，pH为6.50条件下，每分钟从浓度为10mg/mL的燕麦木聚糖溶液中释放1mol还原糖所需要的酶量为一个活力单位（IU）。 夏盛：在50，pH=5.0的条件下，每分钟水解1mg/mL木聚糖产生1g还原糖（以木糖计）所需酶量定义为一个酶活力单位（u）。国家标准：饲用木聚糖酶GB/T23874-2009 在37，pH为5.50条件下，每分钟从浓度为5mg/mL的木聚糖溶液中释放1mol还原糖所需要的酶量为一个活力单位（U）第一篇 酶的生产1、提取分离法l 提取分离法是采用各种提取、分离、纯化技术从动物、植物的组织、器官、细胞或微生物细胞中将酶提取出来，再进行分离纯化的技术过程。l 酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程。l 酶的分离纯化是采用各种生化分离技术，使酶与各种杂质分离，达到所需的纯度，以满足使用的要求。 2、生物合成法l 经过预先设计，通过人工操作，利用微生物细胞、植物或动物细胞的生命活动，获得所需的酶的技术过程。l 据所使用的细胞种类不同，生物合成法可以分为微生物发酵产酶，植物细胞培养产酶和动物细胞培养产酶。自从1949年细菌- 淀粉酶发酵成功以来，生物合成法就成为酶的主要生产方法。 l 生物合成法产酶过程：产酶细胞细胞培养代谢产物分离纯化酶。3 、化学合成法l 化学合成法是采用合成仪进行酶的化学合成，成本高，难以工业化生产。l 用途：酶的人工模拟和化学修饰，对认识和阐明生物体的行为和规律，具有重要的理论意义和发展前景。l 模拟酶是在分子水平上模拟酶活性中心的结构特征和催化作用机制，设计并合成的仿酶体系。第二章 酶生物合成的基本理论第三节 酶生物合成的调节l 根据酶在细胞中的含量变化： 组成酶、适应酶（调节酶）、诱导酶l 酶生物合成的调节控制：转录水平的调节、转录产物的加工调节、翻译水平的调节、翻译产物的加工调节和酶降解的调节等。一、原核生物中酶生物合成的调节机制l 转录水平的调节（基因调节）l 定义：通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度的调节机制，是在基因转录水平上进行的。l 意义：通过阻止酶的过量合成，节约生物合成的原料和能量。Jacob and Monod的操纵子学说（operon theory） 调节基因(regulator gene)：l 可产生一种组成型调节蛋白(regulatory protein) （一种变构蛋白），通过与效应物(effector) （包括诱导物和辅阻遏物）的特异结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基因的结合力。l 调节基因常位于调控区的上游。启动基因（promotor gene）（启动子）：有两个位点： l （1）RNA聚合酶的结合位点l （2）cAMP-CAP的结合位点。l CAP：分解代谢产物基因活化蛋白（catabolite gene activator protein），又称环腺苷酸受体蛋白(cAMP acceptor protein，CAP）。l 只有cAMP-CAP复合物结合到启动子的位点上，RNA聚合酶才能结合到其在启动子的位点上，酶的合成才能开始。 操纵基因（Operater gene）:l 位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能特异性地与调节基因产生的变构蛋白结合，操纵酶合成的时机与速度。结构基因（Structural gene）:l 决定某一多肽的DNA模板，与酶有各自的对应关系，其中的遗传信息可转录为mRNA，再翻译为蛋白质。1、分解代谢物阻遏作用l 指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。l 分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。分解代谢物阻遏现象：l 实验：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二次生长现象”(diauxie或biphasic growth）。l 这一现象又称葡萄糖效应，产生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。分解代谢物阻遏的实质是当葡萄糖存在时，cAMP （环化腺核苷一磷酸）浓度降低，cAMP与CAP结合受阻。分解代谢物阻遏2、诱导作用l 诱导酶（Induced enzyme），在一般情况下不合成，只有当某种基质（底物或底物结构类似物）存在时才合成的酶类。诱导物可以是：l （1）酶的底物，如乳糖诱导乳糖酶，果胶诱导果胶酶。l （2）也可能是分解代谢的产物，如纤维二糖诱导纤维素酶，麦芽糖诱导-淀粉酶。l （3）不能被微生物利用的底物结构类似物或底物衍生物，这类诱导物也叫安慰诱导物。如槐糖诱导纤维素酶等。l 诱导酶合成的调节机制： 加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行。l 酶合成诱导的现象： 已知分解利用乳糖的酶有：-半乳糖苷酶； b -半乳糖苷透过酶；-半乳糖苷乙酰转移酶。实验：l （1）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述三种酶合成；l （2）大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，细胞内有上述三种酶合成；l （3）表明菌体生物合成的经济原则：需要时才合成。3、反馈阻遏作用l 反馈阻遏(feedback repression):酶生物合成的反馈阻遏作用也称为产物阻遏作用。指的是酶催化作用的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受阻的过程。末端产物阻遏l 由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。l 酶合成阻遏的现象：l 实验： （1）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时， 检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在； （2）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。 （3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌体生长的经济原则:不需要就不合成。 色氨酸操纵子酶的阻遏酶的诱导和阻遏操纵子模型二、真核生物酶生物合成的调节l 细胞分化改变酶的生物合成l 基因扩增加速酶的生物合成l 增强子促进酶的生物合成l 抗原诱导抗体酶的生物合成抗体酶l 是一种具有催化功能的抗体分子，在其可变区赋予了酶的属性。是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物。l 已成功开发出天然酶所催化的6种酶促反应和数十种类型的常规反应的抗体酶：酯、羧酸和酰胺键的水解，酰胺键的水解，酰胺形成，光诱导裂解和聚合，酯交换，内酯化等。 抗体酶制备方法l 半抗原诱导法：即用设计好的半抗原，通过间隔链与载体蛋白（例如牛血清白蛋白等）偶联制成抗原，然后采用标准的单克隆抗体来制备、分离、筛选抗体酶。半抗原设计原则就是酶的催化作用机制。常用过渡态类似物半抗原。抗体酶制备方法l 酶蛋白诱导法：用酶作为抗原免疫动物得到抗酶的抗体，再将此抗体免疫动物并进行单克隆化，获得单克隆的抗抗体。对抗抗体进行筛选，应获得具有原来酶活性的抗体酶。l 缺点：具有一定的盲目性和偶然性，并且不能产生新酶。第三章 酶的生物合成法生产第一节 产酶细胞的选择一、酶源l 酶可由动物（如胰蛋白酶、胃蛋白酶）、植物（如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶）和微生物（细菌、霉菌、酵母）产生，其中工业酶制剂大多数由微生物发酵法生产。l 由于微生物世代时间短，繁殖快、容易培养和管理，可大规模工业化生产，所以工业酶制剂大多由微生物发酵产生。l 产酶微生物的获得： 1、从有关菌种保藏机构购买 2、从自然界分离筛选国内一些比较著名的菌种保藏机构l ACCC 中国农业微生物菌种保藏管理中心l ISF 中国农业科学院土壤肥料研究所l CAF 中国林业科学院菌种保藏管理中心l CICC 工业微生物菌种保藏管理中心l IFFI 轻工业部食品发酵工业科学研究所l CMCC 医学微生物菌种保藏管理中心l CVCC 兽医微生物菌种保藏管理中心l YM 云南省微生物研究所l GIMCC 广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心l CCTCC 中国典型培养物保藏中心 ，武汉大学l HKUCC 香港大学保藏中心，香港大学l 台湾新竹BCRC (Bioresources Collection and Research Center)台湾生物资源保存及研究中心（食品工业发展研究所）国外一些比较著名的菌种保藏机构l ATCC (American Type Culture Collection)l NRRL(Agricultural Research Service Culture Collection) 美国农业部菌种保藏中心。l DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)l NBRC (NITE Biological Resource Center)日本技术评价研究所生物资源中心，NBRC（IFO）是由日本经济部、商业部、工业部支持的半政府性质菌种保藏中心。l JCM (Japan Collection of Microorganisms)l VKM (All-Russian Collection of Microorganisms)l CBS (Centraalbureau voor Schimmelcultures荷兰真菌中心收藏所)l UKNCC (United Kingdom National Culture Collection)l NCIMB (National Collections of Industrial, food and Marine Bacteria)英国食品工业与海洋细菌菌种保藏中心2、从自然界中分离筛选产酶微生物l 从与产生目的酶菌种可能相适应的生态环境中，采样分离筛选。l 1克土壤中含有1108个微生物，自然界蕴藏着巨大的微生物资源。l 从不可培养微生物中筛选新酶种。用PCR技术从土样中直接扩增DNA，能够从不可培养的微生物中分离到DNA，并用作克隆来源，可获得更多种类的酶。从极端环境微生物筛选新酶种l 嗜热微生物（Thermophiles 60-85 ， 超嗜热菌生长温度85以上,105 ）。l 嗜冷微生物（Psychrophiles -100 ）l 嗜盐微生物(Halophiles, 含盐32%或5.2%)l 嗜酸微生物(Acidophiles,pH2.5)l 嗜碱微生物(Alkalophiles, pH11)l 嗜压微生物(Barophiles，1.01105Pa,4 107Pa)l 重视微生物资源、基因文库、基因表达载体等方面的建设，以及极端环境微生物，不可分离微生物，绝对厌氧微生物等新的种质资源的研究开发。产酶微生物的分离筛选方法l 1)样品的采集：从富含该酶作用底物的场所采集样品。l 2)富集培养: 投其所好，取其所抗。l 3)分离获得纯培养(pure culture)的微生物。l 4)初筛：选出产酶菌种，以多为主。l 5)复筛：选出产酶水平相对较高的菌株，以质为主。培养基l 细菌：营养肉汤琼脂培养基（pH 7.0，30-37）l 霉菌：可用察氏、土豆（PDA）、麦汁琼脂培养基（pH5.5， 25-28，为了防止霉菌菌落蔓延连成一片，可加入0.1%去氧胆酸钠、0.1%山梨糖等限制菌落扩散）。l 放线菌：高氏培养基、甘油精氨酸培养基等（pH6.8-7.0）。l 酵母：用麦汁琼脂培养基（pH4.5-5.5）。添加药物抑制非目标微生物生长l 为了提高菌种分离效率，分离培养基中可添加一定数量的药剂以抑制干扰微生物的生长。l 如为了抑制霉菌的生长，可加入30-50U/ml 制霉菌素、克念霉素、杀霉素等多烯类抗生素，不妨碍细菌的生长繁殖。l 为了抑制细菌的生长，可添加青霉素（30U/ml）、四环素、猛加拉红（0.001%），不干扰霉菌的生长。l 为了抑制酵母的生长，可添加放线菌酮（50mg/ml）或纳他霉素，不影响细菌的生长。选择性培养基l 用酸性或碱性培养基，可分离耐酸、耐碱微生物；l 用添加了高浓度食盐培养基，可分离耐盐微生物；l 用添加了高浓度盐或蔗糖的培养基，可分离耐高渗透压的微生物；l 在高温下培养，可筛选耐热、耐高温微生物；l 分离芽孢杆菌，可先将样品于80加热10-15min，可杀死不产芽孢微生物后，再进行分离。l 为了提高工作效率，可设计一些肉眼可检测的方法，可设计一些肉眼可检测的方法，如水解透明圈、变色圈等方法，鉴别出产酶菌落。产酶细胞的选择l 用于酶的生产的细胞必须具备的条件：1、酶的产量高2、容易培养和管理3、产酶稳定性好4、利于酶的分离纯化5、安全可靠、无毒性二、产酶微生物1、放线菌（Actinomyces）l 是呈菌丝状生长、以孢子进行繁殖、革兰氏染色阳性的一类原核微生物。由于菌落呈放射状而得名。工业上常用的放线菌有：l 链霉菌属 Streptomyces，生产抗生素、维生素、酶及酶抑制剂。l 诺卡氏菌属 Nocardia，生产抗生素，石油脱蜡、烃类发酵， 处理含氰废水l 小单孢菌属 Micromonospora，生产庆大霉素Rifamycin l 孢囊链霉菌属 Streptosporanium 生产多霉素。l 链霉菌属是放线菌中最大的一个属。l 菌落呈放射状，有分支菌丝体，菌丝直径0.2-1.2m，G+。 菌丝有气生菌丝和基内菌丝之分，基内菌丝不断裂，气生菌丝形成孢子链。可产生葡萄糖异构酶，纤维素酶，碱性蛋白酶，中性蛋白酶，几丁质酶，青霉素酰化酶等。2、细菌l 大肠杆菌（Escherichia coli）：谷氨酸脱羧酶、天冬氨酸酶、青霉素酰化酶、天冬酰胺酶、-半乳糖苷酶、限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、核酸外切酶等l 芽孢杆菌（Bacillus）l 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ）中温-淀粉酶，蛋白酶，纤维素酶l 地衣芽孢杆菌（Bacillus Licheniformis）高温-淀粉酶，碱性蛋白酶l 乳酸菌 谷氨酸脱羧酶3、酵母菌l 啤酒酵母（酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae）可产丙酮酸脱羧酶，醇脱氢酶等。l 假丝酵母（Candida），可产脂肪酶、醇脱氢酶l 巴氏毕赤酵母，甲醇酵母（Pichia pastoris ），基因工程优良表达宿主菌。酵母菌落形态l 固体培养基上菌落湿润、凸起、光滑。质地均匀，但是比细菌菌落大而厚、菌落颜色较为单调，会有酒香。酵母的形态 酵母菌电镜照片4、霉菌l 黑曲霉（Aspergillus niger）l 米曲霉（Aspergillus oryzae）l 青霉（Penicillium）l 木霉（Trichoderma）l 根霉（Rhizopus）l 毛霉（Mucor）l 红曲霉（Monascus）黑曲霉（Aspergillus niger）l 是一种重要的工业微生物，其代谢活力强，安全性高。菌丝体由具横隔的分枝菌丝构成，菌丛黑褐色，顶囊球形，小梗双层，分生胞子球形，平滑或粗糙。l 如黑曲霉可用于生产多种酶，有胞外酶也有胞内酶。如，可产糖化酶、 淀粉酶、酸性蛋白酶，纤维素酶，果胶酶， -葡聚糖酶、木聚糖酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、核糖核酸酶、橙皮苷酶、柚苷酶等。米曲霉（Aspergillus oryzae）l 食品酿造中的常用微生物。菌落一般为黄绿色，后变为黄褐色，分生袍子头呈放射形，顶裹囊球形或瓶形，小梗一般为单层，分生孢子球形，平滑少数有刺，分生孢子梗长2mm左右，粗糙。l 米曲霉可用于生产蛋白酶和糖化酶，这在我国传统的酒曲和酱油曲中得到广泛应用。此外，米曲霉还用于生产真菌-淀粉酶、氨基酰化酶、磷酸二酯酶、核酸酶P1、果胶酶等。青霉菌（Penicillium）l 营养菌丝体无色、淡色或具鲜明颜色。菌丝