高效制备感受态.doc

在科研实验中，为了获得纯的重组质粒DNA，需要允许外源DNA分子进入的细胞。经过一些特殊方法（电击法、CaCl2法）等处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞，即感受态细胞。基本制备步骤1.从37培养16-20 h的平板中挑取一个单菌落(直径2-3 mm)，转到一个含有100 ml LB或SOB培养基的1L烧瓶中。于37剧烈振摇培养3 h。一般经验，1 OD600约含有大肠杆菌DH5 109 个/mL。2.将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中，在冰上放置10 min，使培养物冷却至0。3.于4用Sorvall GS3特头（或与之相当的转头）以4 100 r/min离心10 min，以回收细胞。4.倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。5.每50 ml初始培养液用30 ml预冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。6.于4用Sorvall GS3转头（或与之相当的转头）以41 00 r/min离心10 min，以回收细胞。7.倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。8.每50 ml初始培养物用2 ml用冰预冷的0.1 mol/L CaCl2(或TFB)重悬每份细胞沉淀。9.此时，可以用新鲜制备的感受态细胞直接做转化实验，也可以将细胞冻存于- 70。洁净是最重要的无菌都无所谓，在操作台上可正常操作。离心力要注意不要超过2500g,建议1500-2000g 5min。涂板要注意，不要觉得不匀而多次反复。轻轻在平板上带一下感觉板上大部分地方走过即可，特别在冰箱中保存过或在温箱中温浴2小时以上的板。涂完后建议空气晾干（20-30分钟）这样会减少卫星菌落出现。预冷是必要的。整个过程的低温也并非特别重要，只要注意就行了，我在去残液时经常在室温倒置1min，对感受态效率提高有帮助，第一次多加一点缓冲液，我经常加至20ml，效果不错。关于感受态的制备方法关于大肠杆菌的感受态制备及转化的方法很多，最复杂的莫过于电转化，而最简单的则是将LB平板上的菌落直接挑入装有缓冲液的EP管冰箱即开始转化。对于做克隆工作的人而言，高而稳定的感受态可减轻不少麻烦。东澳大肠杆菌感受态列表BL21(DE3)chemically Competent Cell产品特点：BL21菌株用于以T7 RNA聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主。T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达受控于噬菌体DE3区的lacUV5启动子，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合于非毒性蛋白的表达。DH5 Chemically Competent Cell产品特点：大肠杆菌DH5是一种常用于质粒克隆的菌株，在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的-半乳糖苷酶氨基端实现-互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。STBL3 Chemically Competent Cell产品特点：STBL3感受态细胞是慢病毒载体系统推荐使用的菌株，可有效抑制长片段末端重复区的重组，降低错误重组的概率。Top 10 Chemically Competent Cell产品特点：TOP10感受态细胞是一种常用于质粒克隆的菌株，适用于高效的质粒DNA克隆并能保证高拷贝质粒的稳定复制。使用方法：1 从-70 超低温冰箱中取出一管感受态菌，冰浴10 min使其解冻；2 加入适量目的质粒DNA，冰浴30 min；3 插入42水浴中90S进行热休克，然后冰浴5 min；4 加入0.7ml无抗LB培养基（培养基预热至37），然后37 160-180rpm/min震荡培养45-60min；5 取上述转化混合液100-300l，在含合适抗菌素的固体LB平板培养皿上用玻璃涂布棒涂布均匀；6 *如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话，