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水通道蛋白 AQP2 翻译后修饰及表达调控 范莉莉张丹丹段新鹏王晓艳谷瑞民 哈尔滨医科大学 哈尔滨 150081 摘要AQP2 aquaporin 2 是一种水通道蛋白 表达于集合管的主细胞 其活性主要受抗利尿激素 arginin vasopressin AVP 调控 AVP 调节的 AQP2 数量和细胞内定位在维持机体水代谢平衡和尿 液浓缩中发挥着决定性的作用 AQP2 受多种修饰 如磷酸化 泛素化 糖基化等 本文根据最新 的文献报道 着重介绍了 AQP2 翻译后修饰及调控机制 关键词AQP2 肾脏 AVP 中图分类号 334 肾脏是机体主要的排泄器官 通过尿液的形成 和排出 实现调节机体的水代谢平衡 肾小管对水 的渗透性是由一种特殊的膜蛋白 水通道蛋白调节 的 至今已发现的水通道蛋白有 13 种 在肾脏表达 的有 8 种 其中 AQP2 在肾脏对水平衡的调节中起 最重要的作用 AQP2 表达于肾脏集合管的主细 胞 其功能活动主要受 AVP 调控 AQP2 门控机制 仍存在很多争论 但不可否认 AQP2 通过出胞和入 胞活动维持其在顶端膜上的表达 从而成为水重吸 收和尿液浓缩的限制因素 其他的全身因素或激素 也参与调节 AQP2 的功能 如 Ang 等 此外 有研 究表明 在集合管细胞的基底外侧膜和连接小管也 可检测到有 AQP2 的表达 基底外侧膜上的 AQP2 参与上皮细胞的迁移和肾小管形态的形成 1 一 AQP2 的翻译后修饰 翻译后修饰是改变靶蛋白性能的过程 翻译后 修饰能够调节真核生物的蛋白质活性 在细胞内的 信号转导 蛋白质的成熟和折叠中起着非常重要的 作用 翻译后修饰可以改变蛋白质的功能 活性 定 位 稳定性以及与其他蛋白质的相互作用 一种特 殊类型的翻译后修饰可能会促进其邻近氨基酸进行 翻译后修饰 AQP2 的翻译后修饰主要包括磷酸 化 泛素化和糖基化 一 磷酸化AQP2 在羧基末端有 5 个磷酸化 位点 分别是苏氨酸 224 位点 S224 和丝氨酸 256 位点 S256 丝氨酸 261 位点 S261 丝氨酸 264 位点 S264 和丝氨酸 269 位点 S269 人类为苏氨 酸 其中苏氨酸 224 位点不受 AVP 调控 AVP 可 以增加 S256 S264 和 S269 位点的磷酸化 降低 S261 位点的磷酸化 2 AQP2 羧基末端 S256 位点 是 AQP2 最具特色的磷酸化位点 其磷酸化作用是 第一个被发现的 S256 磷酸化位点是 AQP2 羧基 末端多磷酸化区域的一部分 是 PKA 诱导磷酸化作 用的靶点 应用 V2 受体 V2 激动剂可以增加 AQP2 的 S256 S264 和 S269 的磷酸化作用 其中首 先发生磷酸化的是 S256 随后下游部位发生磷酸 化 S256 的最强磷酸化作用发生于 60s 内 而其他 位点要达到最强磷酸化要花费更长的时间 S256 的磷酸化在 AQP2 向集合管细胞顶端膜转运和调节 羧基末端其他磷酸化作用中起着关键作用 3 最 近的研究显示 4 型乙酰茶碱可以抑制 cAMP PKA 依赖的 AQP2 S256 位点的磷酸化作用 磷酸 化 的 AQP2 丝 氨 酸 256 位 点 pS256 AQP2 可以在集合管上皮细胞的囊泡和管周膜上检 测到 这有利于响应 AVP 的调控作用 pS261 AQP2 显著地定位于细胞内除内质网 高尔基体和溶酶的 区域 大多数的 pS264 AQP2 存在于与浆膜有关的 区域 且与早期 AQP2 的内吞作用有关 另外 用 dDAVP 急性刺激集合管时 pS264 AQP2 在主细胞 的顶端膜和基底膜都增加 pS269 AQP2 不存在于 任何细胞内区域 但可以检测到在集合管的主细胞 顶端膜上表达 负责调控 S261 S264 和 S269 磷酸化作用的蛋 白激酶目前还存在争议 可以确定的是 PKG 通过 增加 cGMP 的信号转导过程参与 AQP2 羧基末端磷 酸化 4 多肽物质在体外实验中的磷酸化作用表 明 c Jun N 末端激酶 p38和细胞周期蛋白依赖的 国家自然科学基金 31171110 31371170 资助课题 通讯作者 732 生理科学进展 2015 年第 46 卷第 3 期 激酶 cdk1 cdk5 可以使 S261 磷酸化 5 S269 与 AQP2 在细胞膜的积聚有关 它有可能受 PKA 和 PKG 两种蛋白激酶调节 除此之外 酪蛋白激酶和 其他的激酶以及一些磷酸酶也参与调控 AQP2 的磷 酸化和活性 6 二 泛素化与磷酸化相比 泛素化是一个更 复杂的翻译后修饰 AQP2 的多聚泛素化发生在酪 氨酸270 位点 伴随着1 到3 个泛素插入 K63 链 7 AQP2 泛素化导致 AQP2 由管周膜向细胞内移动 泛素表达于所有类型的细胞 它与靶蛋白结合的过 程涉及三种酶 泛素激活酶 E1 激活泛素 活化的泛 素与泛素结合酶 E2 结合 最后泛素连接酶 E3 催化 泛素由泛素结合酶 E2 转移到靶蛋白 与靶蛋白结 合 与磷酸化作用相似 泛素化作用可以被许多刺 激物质诱导 它也是一个可逆的过程 泛素化作用 通常需要蛋白首先发生磷酸化以使泛素化酶能够 识别 AQP2 的泛素化具有两种作用 一是参与其内 在化 泛素化能够调节细胞的内吞作用 抑制泛素 化作用可以引起 S256 AQP2 和 或 S269 AQP2 的磷 酸化 减慢水通道蛋白内吞作用的速度 二是参与 蛋白质数量和蛋白质降解的调节 实验证明 AQP2 发生泛素化后 就会直接进入降解的阶段 表明泛素 化的另一个作用是使 AQP2 降解 并且泛素化与降 解平行发生 三 糖基化膜蛋白细胞内的区域与 O 和 N 糖链结合有利于蛋白在膜上的定位 AQP2 的糖基 化修饰是 N 糖基化 在哺乳动物的细胞中糖基化 的检测似乎被许多因素复杂化 如实验用细胞的类 型和细胞培养环境等 在对其他膜蛋白如 NHE3 Na H exchanger 的研究中发现 糖基化具有高 度的种族特异性 应用不同的细胞培养系统和动物 模型可以检测到 AQP2 的糖基化程度明显不同 应 用免疫印迹法将大鼠或人的 AQP2 在狗的细胞内培 养 或将鼠的 AQP2 在猪细胞内表达 发现 AQP2 不 发生或很少发生糖基化 与之对比的 用鼠集合管 细胞或鼠 AQP2 转染的人细胞系进行实验 糖基化 和非糖基化的 AQP2 均可检测到 这就表明 AQP2 的糖基化不仅受种群的影响 也可能还与糖基化酶 的构成和表达有关 AQP2 糖基化的作用至今了解 很少 通过卵母细胞水渗透压的实验 可以得出糖 基化不影响 AQP2 的生理功能 其他的实验表明糖 基化对 AQP2 由高尔基体移出并向细胞膜靶向运输 是必不可少的 但仍然有许多证据表明 在某些种类 的细胞 AQP2 向细胞膜的靶向运输不需要糖基化 的参与 二 AVP 介导的 AQP2 功能 AVP 即抗利尿激素 antidiuretic ADH 也称为 精氨酸加压素 arginin vasopressin AVP 是由下丘 脑视上核和室旁核的神经细胞分泌的九肽类激素 为尿液浓缩和稀释的关键性化学物质 其主要作用 是调节远曲小管和集合管对水的通透性 维持体内 水平衡和细胞外液渗透压浓度的稳态 对保护组织 细胞的正常形态及功能具有重要意义 低血容量或 血浆胶体渗透压升高分别刺激大动脉 颈动脉的压 力感受器或下丘脑的渗透压感受器 下丘脑分泌神 经垂体释放抑制尿液分泌的肽类激素 AVP 8 AVP 发挥作用主要通过 V2 介导 V2 是一种 Gs 蛋白 偶联受体 正常情况下 活化的 V2 可以激活 型 和 型腺苷酸环化酶 AC AC 能够使细胞内的 ATP 转化为 cAMP cAMP 进一步激活 PKA 从而直接或 间接的使 AQP2 磷酸化 磷酸化的 AQP2 促使含有 AQP2 的囊泡向顶端膜移动 导致 AQP2 在管周膜上 积聚 9 这一作用是由网格蛋白介导的出胞作用 和受体降解所调节的 转铁蛋白与转铁蛋白受体结 合能够增加 V2 的内在化 尽管这些证据说明 G 蛋白偶联受体的活化作用能够调控 V2 在细胞膜 上的表达 但是它在生理学上的功能尚不明确 在 纤毛发育不完全的多囊肾病细胞模型上 V2 集中 表达于顶端膜 这表明纤毛也可能在 V2 的表达定 位上起着非常重要的作用 另外 V1a 受体表达于 集合管的官腔膜上 它也与调控 AQP2 的表达及尿 液浓缩有关 在肾脏集合管 AVP 对水的渗透性调节包括两 个过程 第一个过程是短期调节 发生在数分钟内 主要是调节含有 AQP2 的囊泡往返于细胞内和顶端 膜上 第二个过程是长期调节 发生于数小时到数 天之内 主要调节细胞内 AQP2 的数量 一 AVP 对 AQP2 的短期调节 1 AVP 介导的 AQP2 的转运 离体灌注集合管 的实验表明 AVP 能够快速增加集合管对水的通透 性 这是由于在 AVP 的作用下 AQP2 积聚于集合 管细胞的顶端膜 AVP 诱导 AQP2 由细胞内囊泡向 顶端膜的运输包括两个步骤 一是加快 AQP2 出胞 速度 二是减慢 AQP2 入胞速度 顶端膜上 AQP2 的数量是 AQP2 出胞和入胞达到平衡时的结果 AVP 可以通过分别调节含有 AQP2 囊泡的出胞和入 胞活动调节 AQP2 的转运 最新的研究表明 AVP 832 生理科学进展 2015 年第 46 卷第 3 期 促进 AQP2 在顶端膜上的累积可以被 cGMP cGK 抑制 10 2 肌动蛋白动力学与 AQP2 的出胞作用 在皮 质集合管细胞 胞吐活动中一个非常重要的过程是 AVP 诱导 F 肌动蛋白的解聚 肌动蛋白微丝所形 成的稠密的皮质网能够阻碍含有 AQP2 的囊泡向顶 端膜移动 因此肌动蛋白的解聚作用能够促进 AQP2 囊泡的出胞作用 肌动蛋白的聚合作用受 ho 家族激酶的调节 在自然杀伤淋巴细胞 ho 在邻近羧基末端的丝氨酸 188 位点 Ser188 被 PKA 磷酸化 这一作用导致 hoA 从膜相关效应蛋白上 分离 主要是 ho ac Cdc42 激活的激酶 在集合 管细胞 AVP 增加 hoA Ser188 磷酸化导致肌动蛋 白解聚 11 抑制 hoA 也可以引起 F 肌动蛋白局 部解聚 有人发现 pS256 AQP2 与增加 AQP2 与原 肌球蛋白 5b 的亲和力和减少其与 G 肌球蛋白的相 互作用有关 因此能促进 F 肌动蛋白的解聚 3 AQP2 磷酸化与 AQP2 胞吞作用的调节 同前 所述 AVP 调节集合管上皮细胞顶端膜上 AQP2 的 数量部分是通过调节 AQP2 胞吞作用来实现的 受 AVP 调节的 4 个羧基末端磷酸化位点 有 2 个参与 AQP2 胞吞作用的调节 即 S261 和 S269 在内髓集 合管细胞 AVP 能够大幅度降低 AQP2 S261 位点的 磷酸化 S261 磷酸化位点与泛素化位点 K279 通过 加速 AQP2 降解调节 AQP2 的胞吞作用 AVP 介导 的 AQP2 S269 磷酸化抑制 AQP2 的内吞作用 二 AVP 对 AQP2 的长效调节AVP 对 AQP2 的长效调节主要表现为对集合管顶端膜上 AQP2 数 量的调节 目前已经确定 AVP 对 AQP2 的长效调 节可以增加 AQP2 在肾脏集合管上的数量 AQP2 在集合管上的数量保持稳定说明翻译所产生的 AQP2 与 AQP2 在细胞内的降解和细胞外分泌的过 程保持平衡 1 尿液的排出 在稳定状态下 尿液中 AQP2 增 加反应 AQP2 的合成增加或降解减少 这两个过程 都与细胞内 AQP2 的数量增加有关 且说明 AVP 活 性增加 然而 如果稳定状态没有建立 尿液中 AQP2 增加仅反应 AQP2 出胞作用暂时增加 AVP 的活性降低 此外 尿液的碱化作用也可以增加 AQP2 排出 此过程不依赖 AVP 12 2 AQP2 的降解 AQP2 蛋白的降解率可以利用 脉冲追踪法在体外培养的细胞进行测定 然而这种 方法在正常动物体内无法进行 AQP2 的降解可能 是通过渗入溶酶体或蛋白酶体内进行的 蛋白质都 是通过泛素化进行标记的 单泛素化或低泛素化靶 蛋白在溶酶体内降解 多泛素化靶蛋白在蛋白酶体 内降解 虽然 AQP2 的泛素化属于多聚泛素化 但 其进行降解的位置仍不能完全确定 大量的研究数 据证明 AVP 能够增加 AQP2 的半衰期 但增加的幅 度很小以至于在 AVP 对蛋白质的长期调控中无法 观察到 3 AQP2 的产生 在集合管细胞 AQP2 的生成 数量是由 AQP2 m NA 的数量或直接调节翻译过程 所决定的 AVP 能明显增加鼠集合管 AQP2 m NA 的数量 表明 AQP2 翻译的增加至少部分是由于 AQP2 m NA 的水平增加 很多学者认为 调节 AQP2 数量的主要因素是 AQP2 的基因转录 AVP 引起的 AQP2 m NA 和蛋白水平增加可以被放线菌 素 D 一种抑制转录的药 所阻滞 说明 AVP 参与调 节 AQP2 基因表达的转录后翻译 AQP2 的转录主 要是由 V2 cAMP PKA 信号转导通路介导的 同时 也受其他因素的调节 包括 TonEBP 和 NF B 13 除此之外 与 AVP 功能相关的蛋白包括 Mal2 Akap12 凝胶溶素 肌球蛋白轻链激酶 膜联蛋白 2 和 Hsp70 也能够改变 AQP2 的翻译率 三 结语与展望 随着大量先进的实验技术的应用 我们对 AQP2 的功能以及调控的了解不断增加 这对研究 机体水平衡调节以及临床上疾病的治疗有着非常重 要的意义 AQP2 是在 AVP 的调控下发挥作用的 而近年的研究发现 AQP2 也存在一些不依赖 AVP 的作用机制 如绕过缺陷的 V2 使 AQP2 在肾主细 胞顶端膜上积聚的通路是可行的 用于治疗肾性尿 崩症 一些化学物质如磷酸二酯酶 5 PDE5 抑制 剂昔多芬 磷酸二酯酶 4 PDE4 抑制剂咯利普兰 他汀类药物 降钙素和前列腺素受体选择性激动剂 等能够成功的增加细胞膜 AQP2 的积聚而不依赖 AVP 但是这些药物是否可以应用于人类来治疗疾 病仍不明确 14 未来的研究可能致力于探索是否 存在独立于 AVP 的机制来调控 AQP2 的功能以及 AQP2 在肾脏其他部位的表达情况及功能 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