蚕豆病生化设计实验ppt课件

2011级临床四大班第四实验室1 2小组组员 杨从德 201101171 王永波 201101168 武桂芬 201101170 王小花 201101167 试验时间 第十八周 生化设计实验 yangcongde 一 根据上述患儿的临床表现和实验室检查 初步判断患儿是何种疾病 蚕豆病 恶心 呕吐 面色苍白 皮肤及巩膜黄染 红细胞1 98 1012 L 血红蛋白53g L 血清总胆红素85 5 mol L 尿蛋白 尿胆红素 尿胆素原 尿液镜下未见红细胞 黄疸 红细胞膜不完整 已破裂 红细胞含量少 含量明显增加 血红蛋白量减少 排尿呈酱油样色 游离胆红素增加 溶血性黄疸 蚕豆病 肠肝循环增多 蚕豆病简介 蚕豆病是一种6 磷酸葡萄糖脱氢酶 G 6 PD 缺乏所导致的疾病 表现为在遗传性葡萄糖 6 磷酸脱氢酶 G 6 PD 缺陷的情况下 食用新鲜蚕豆后突然发生的急性血管内溶血 易发人群 多见于儿童 男性患者约占90 以上 二 设计实验 2 设计实验进一步明确诊断 贫血 黄疸 有和无遗传史 无或有诱因 食用蚕豆 服用药物 感染 体征 脾肿大 黄疸 血常规检查 血清学检查 检查HA的病因 G6PD筛选试验 G6PD确诊试验 Hb 网织红细胞 间接胆红素 尿胆原 游离Hb 结合珠蛋白 怀疑其他HA 相应病因检测结果正常 G6PD荧光斑点试验 红细胞G6PD活性测定 G6PD基因分析 其他筛选试验 高铁血红蛋白还原试验 初诊或确诊G6PD缺陷症 确诊溶贫 血管内溶血 确诊G6PD 做1项或2项 做1项 高铁血红蛋白还原试验G6PD荧光斑点试验红细胞G6PD活性测定 筛选试验 确诊试验 实验原理 一 高铁血红蛋白还原试验 实验原理 在全血中加入亚硝酸钠 使红细胞中的亚铁血红蛋白氧化为高铁血红蛋白 MHb 高铁血红蛋白在高铁血红蛋白还原酶的作用下又被还原为亚铁血红蛋白 在这过程中 高铁血红蛋白还原酶不仅需要亚甲蓝作为递氢体 还需要由G6PD参与磷酸戊糖途径形成NADPH作为辅酶才完成上述反应 所以 G6PD缺陷症的患者其MHb还原率下降 分光光度技术 主要试剂 0 18mol L亚硝酸钠 葡萄糖溶液 0 4mmol L亚甲蓝溶液 0 28mol L葡萄糖溶液 混合液 等量 生理盐水 抗凝剂 仪器 紫外分光光度计水浴箱 离心机 试管3支 高铁血红单白还原实验 实验流程 取静脉血1 8mL于抗凝管 混匀抗凝管 含0 2mL109mmol L抗凝剂 葡萄糖20mg 离心沉淀1000r min15min 调整血细胞 血浆 1 1 混匀 调整后全血 备用 1ml0 18mol L亚硝酸钠1ml0 28mol L葡萄糖溶液混匀 混合试剂 备用 1ml0 14mmol L亚甲基蓝液 高铁血红单白还原实验 实验流程 取试管3支 标上A B S 按下表加入试剂 高铁血红蛋白还原试验操作步骤 混合试剂 mL0 01 生理盐水 mL 0 01 0 18mol L亚硝酸钠 0 010 28mol L葡萄糖溶液 mL经调整的全血 mL0 10 10 1来回摇动15 20次 置37 水浴箱静置3h蒸馏水10 00ml10 00ml10 00ml 试剂ABS 高铁血红单白还原实验 B管为空白管 在波长635nm处 测定 A 管及 S 管吸光度 实验流程 计算高铁血红蛋白还原率公式 MHb 1 A S 100 高铁血红单白还原实验 二 G6PD荧光斑点试验 实验原理 葡萄糖 6 磷酸 G6P 在G6PD作用下形成6 磷酸葡萄糖 6PGA 同时使NADP转变为NADPH 后者在340nm波长紫外线照射下产生荧光 反应原理如下图 所以将含有G6P和NADP等的混合试剂与血混匀后在0分钟 5分钟 10分钟分别取1滴血到滤纸上 通过观察滤纸上有荧光出现时间可判断G6PD活性 NADPNADPH G6P6PGA G6PD 实验原理 试剂 反应液 G 6 P液1份 NADP液1份 皂素2份 磷酸盐缓冲液3份和蒸馏水3份混匀 仪器 长波紫外灯 滤纸 水浴箱 G6PD荧光斑点试验 实验流程 G6PD荧光斑点试验 取试管 加10 l全血 100 l反应液 混匀 取一滴于滤纸上 第一斑点 作为对照 将上液置于37 水浴10min 再取一小滴滴于滤纸上 第二斑点 实验组 晾干后 于长波紫外灯下 365nm 观察结果 计时 根据结果作出相应诊断 三 红细胞G6PD活性测定 实验原理 基本原理同G6PD荧光斑点实验 不同的是利用紫外光分光光度法定量测定酶活性 即每隔一分钟在340nm波长测定孵育液中NADPH吸光度 测6次 求每分钟吸光度增加的平均值 根据单位时间内NADPH生成由于所用试剂及体系的不同 方法 WHO推荐的Zinkham NBT定量法等 实验原理 试剂 生理盐水 溶血素 3 8mmol LNADP 0 5mol LTris缓冲液 pH7 5 0 63mol L氯化镁溶液 33mmol LG 6 P液 仪器 紫外分光光度计水浴箱 离心机 试管 实验流程 取抗凝血2ml 生理盐水洗涤红细胞3次 1500r min离心10min 除去上清液和乳白层 白细胞和血小板 加等体积生理盐水 红细胞悬液 红细胞悬液0 05ml 溶血素0 5ml 混合 放置10min 溶血液并测定其Hb浓度 进行比色 见下表 红细胞G6PD活性测定 G 6 PD活性测定的操作表 Zinkham法 试管对照管测定管 NADP液 ml 0 10 1Tris液 ml 0 10 1氯化镁液 ml 0 10 1蒸馏水 ml 0 680 58G6P液 ml 0 137 预热溶血液 l 2020 红细胞G6PD活性测定 立即340nm处测吸光度 以对照管调零 37 恒温 每分钟观察1次 记录吸光度的变化 实验流程 计算公式 G 6 PD活性 U gHb A min 1000 6 22 1020 20 Hb gL 1 A min 每min吸光度的平均变化值1000 6 22 为微摩尔消光系数1020 20 总容量与溶血液的量之比 实验流程 红细胞G6PD活性测定 结果分析方法 一 高铁血红蛋白还原试验 正常值 MHb还原率 75 脐血 77 临床诊断 纯合子和半合子 XY 患者 MHb还原率 30 脐血 40 杂合子患者 MHb还原率 31 74 脐血 41 76 二 葡萄糖 6 磷酸脱氢酶荧光斑点试验正常人 0min斑点无荧光 5 10min出现 10min荧光最强临床诊断 轻度缺陷者 0 10min荧光很弱或不出现中度缺陷者 10 30min出现荧光严重缺陷者 30min内不出现荧光 结果分析方法 三 葡萄糖 6 磷酸脱氢酶活性测定G6PD缺陷者 G6PD活性较正常平均值低40 以上即可作出诊断 方法正常值范围 WHO推荐的Zinkham 12 01 2 09 IU gHb 37 ICSH推荐的Glock与McLoan法 8 34 1 59 IU gHb 37 NBT定量法 13 1 30 0 NBT单位Chapman和Dern法 2 8 7 31 IU gHb 25 结果分析方法 三 从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室检查结果 细胞膜的破坏 胆红素的异常 红细胞膜的破坏 葡萄糖磷酸戊糖途径 葡萄糖6 磷酸葡萄糖 5 磷酸核糖 NADPH H 磷酸化 5 磷酸核糖 磷酸戊糖途径 NADPH H 5 磷酸核糖 NADPH H 5 磷酸核糖 NADPH H 5 磷酸核糖 NADPH H NADPH维持GSH 谷胱甘肽 的正常含量和还原状态 G6PD 6 磷酸葡萄糖脱氢酶 起关键作用 还原型谷胱甘肽体内重要的抗氧化剂保护红细胞膜蛋白的完整性 红细胞膜的破坏 单核吞噬细胞识别吞噬 血红蛋白 珠蛋白 氧化破坏 红细胞 氧化破坏 红细胞 单核吞噬细胞识别吞噬 氧化破坏 红细胞 血红蛋白 单核吞噬细胞识别吞噬 氧化破坏 红细胞 珠蛋白 血红蛋白 单核吞噬细胞识别吞噬 氧化破坏 红细胞 血红素 珠蛋白 血红蛋白 单核吞噬细胞识别吞噬 氧化破坏 红细胞 单核吞噬细胞识别吞噬 血红蛋白 珠蛋白 氧化破坏 红细胞 氧化破坏 红细胞 单核吞噬细胞识别吞噬 红细胞 血红蛋白 单核吞噬细胞识别吞噬 红细胞 珠蛋白 血红蛋白 单核吞噬细胞识别吞噬 红细胞 血红素 珠蛋白 血红蛋白 单核吞噬细胞识别吞噬 红细胞 胆红素代谢异常 血红素 运送到肝 与血清蛋白结合 游离胆红素 结合胆红素 排出体外 进入肠道 胆素原 胆素 肠肝循环 胆红素 扩散进入组织组织黄染黄疸 排尿呈酱油样色 溶血性贫血面色苍白 四 要想探讨该病发生的分子基础 可以用哪些技术检测什么目的基因 选答 基因结构分析法 我组讨论认为 要想探讨该病发生的分子基础 需要对目的基因进行基因结构分析 即DNA序列检测 DNA序列测定方法 直接法 间接法 对于未知片段 或片段过长 用几种方法 RFLP PCR RFLP SSCP 来粗略的估计待分析基因的一级结构是否与对照基因相同 双脱氧末端终止法 Sanger法 化学裂解法 Maxam Gilbert法 DNA的自动化测序 DNA序列测定方法 DNA链的方向是5 3 交替的磷酸基团和戊糖构成了DNA的骨架 backbone 五 患者体型瘦小与该病症是否有关 为什么 选答 患者体型瘦小与该病症有关 蚕豆病是因为体内缺乏G6PD G6PD主要影响体内的磷酸戊糖途径该途径主要生成两种重要的物质即5 磷酸核糖和NADPH 5 磷酸核糖影响 1 核酸的合成2 体内己糖和戊糖的代谢3 3 7碳原子糖类物质的相互转化 NADPH影响 1 体内以NADPH作为供