TaqDNA聚合酶.doc

学习资料收集于网络，仅供参考TaqDNA聚合酶科技名词定义 中文名称：TaqDNA聚合酶 英文名称：Taq DNA polymerase 定义：编号：EC 2.7.7.7。存在于水生嗜热菌(Thermus aquaticus)的嗜热DNA聚合酶，可在74复制DNA，在95仍具有酶活力。该酶可在离体条件下，以DNA为模板，延伸引物，合成双链DNA。这个酶只有53DNA聚合酶活性和53的外切酶活性，缺少35的外切酶活性。 目录简介 催化活性 校对活性简介Taq DNA聚合酶是从一种水生栖热菌(Thermusaquaticus)yT1株分离提取的.yT是 一种嗜热真细菌，能在7075生长.该菌是1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离的。该酶基因全长2496个碱基，编码832个氨基酸，酶蛋白分子为 94KDa.其比活性为200000单位/mg.7580时每个酶分子每秒钟可延伸约150个核苷 酸，70延伸率大于60个核苷酸/秒，55时为24个核苷酸/秒.温度过高(90以上) 或过低(22)都可影响Taq DNA聚合酶的活性，该酶虽然在90以上几乎无DNA合成， 但确有良好的热稳定性，在PCR循环的高温条件下仍能保持较高的活性.在92.5、95 、97.5时，PCR混合物中的Taq DNA聚合酶分别经130min，40min和56min后，仍可 保持50%的活性，实验表明.PCR反应时变性温度为9520sec，50个循环后，Taq DNA聚合酶仍有65%的活性.Taq DNA聚合酶的热稳定性是该酶用于PCR反应的前提条 件，也是PCR反应能迅速发展和广泛应用的原因.Taq DNA聚合酶还具有逆转录活性， 其作用于类似逆转录酶.此活性温度一般为6568，有Mn2+存在时，其逆转录活性 更高. 催化活性TaqDNA聚合酶是Mg2+依赖性酶，该酶的催化活性对Mg2+浓度非常敏感.以活性程度 很低的鲑鱼精子DNA为模板，dNTP的浓度为0.70.8mmol/L时，用不同浓度Mg2+进行 PCR反应10min，测定结果为Mgcl2浓度在2.0mmol/L时该酶催化活性最高，此浓度能最 大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性，Mg2+过高就抑制酶活性，当Mgcl2浓度在 10mmol/L时可抑制4050%的酶活性.由于Mg2+能与dNTP结合而影响PCR反应液中游离 的Mg2+浓度，因而Mgcl2的浓度在不同的反应体系中应适当调整，优化浓度.一般反应 中Mg2+浓度至少应比dNTP总浓度高0.51.0mmol/L.适当浓度的KCL能使Taq DNA聚合 酶的催化活性提高5060%，其最适浓度为50mmol/L，高于75mmol/L时明显抑制该酶 的活性. 校对活性该酶无校对活性，易产生错配碱基。 Taq DNA聚合酶详答 文章来源：互联网 文章作者：未知 发布时间：2006-10-18 字体： 大 中 小 Taq DNA聚合酶是从一种水生栖热菌(Thermusaquaticus)yT1株分离提取的.yT是 一种嗜热真菌，能在7075生长.该菌是1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉 中分离的.(一)酶活性与热稳定性该酶基因全长2496个碱基，编码832个氨基酸，酶蛋白分子为 94KDa.其比活性为200000单位/mg.7580时每个酶分子每秒钟可延伸约150个核苷 酸，70延伸率大于60个核苷酸/秒，55时为24个核苷酸/秒.温度过高(90以上) 或过低(22)都可影响Taq DNA聚合酶的活性，该酶虽然在90以上几乎无DNA合成， 但确有良好的热稳定性，在PCR循环的高温条件下仍能保持较高的活性.在92.5、95 、97.5时，PCR混合物中的Taq DNA聚合酶分别经130min，40min和56min后，仍可 保持50%的活性，实验表明.PCR反应时变性温度为9520sec，50个循环后，Taq DNA聚合酶仍有65%的活性.Taq DNA聚合酶的热稳定性是该酶用于PCR反应的前提条 件，也是PCR反应能迅速发展和广泛应用的原因.Taq DNA聚合酶还具有逆转录活性， 其作用于类似逆转录酶.此活性温度一般为6568，有Mn2+存在时，其逆转录活性 更高.(二)离子依赖性aqDNA聚合酶是Mg2+依赖性酶，该酶的催化活性对Mg2+浓度非常敏感.以活性程度 很低的鲑鱼精子DNA为模板，dNTP的浓度为0.70.8mmol/L时，用不同浓度Mg2+进行 PCR反应10min，测定结果为Mgcl2浓度在2.0mmol/L时该酶催化活性最高，此浓度能最 大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性，Mg2+过高就抑制酶活性，当Mgcl2浓度在 10mmol/L时可抑制4050%的酶活性.由于Mg2+能与dNTP结合而影响PCR反应液中游离 的Mg2+浓度，因而Mgcl2的浓度在不同的反应体系中应适当调整，优化浓度.一般反应 中Mg2+浓度至少应比dNTP总浓度高0.51.0mmol/L.适当浓度的KCL能使Taq DNA聚合 酶的催化活性提高5060%，其最适浓度为50mmol/L，高于75mmol/L时明显抑制该酶 的活性.(三)忠实性TaqDNA聚合酶具有53聚合酶活性和53外切酶活性，而无35外切活 性，它不具有Klenow酶的35校对活性.因而，在PCR反应中如发生某些碱基的错 配，该酶是没有校正功能的.Taq DNA聚合酶的碱基错配机率为2.110-4.(四)抑制剂低浓度的尿素、甲酰胺、二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亚砜(DMSD)对Taq DNA聚合酶的 催化活性并无影响.极低浓度的离子表面活性剂如脱氧胆胺酸钠(小于0.06%)，十二烷 基肌氨酸钠(小于0.02%)，十二烷基硫酸钠(SDS，小于0.01%)几乎可完全抑制该酶的 活性.而非离子表面活性剂在较高浓度(Tween20，NP-40.和Tritox-100)如5%时方能 抑制该酶的活性.变性剂对TaqDNA聚合酶活性的影响变性剂浓度 活性(%)乙醇3%10010%110尿素0.5mol/L1001.0mol/L1181.5mol/L1072.0mol/L82DMSO1%10010%5320%11DMF5%10010%8220%17甲酰胺1%10015%8620%39SDS0.001%1050.01%100.1%0.1低浓度的NP-40(0.05%)和Tween20(0.05%)能增强TaqDNA聚合酶的活性.低浓度SDS对 该酶的抑制作用可加入一定浓度的NP-40和Tween20抵消.TaqDNA聚合酶可在-20贮 存至少6个月.产品编号产品名称产品包装产品价格D7216Pfu DNA Polymerase100U96.00元Pfu DNA Polymerase简称Pfu酶，是最常用的高保真DNA聚合酶之一。Pfu DNA Polymerase是一种来源于嗜热菌Pyrococcus furiosus的高度热稳定的DNA聚合酶。Pfu酶的分子量为90kDa。Pfu酶可以催化5至3方向的依赖于DNA模板的脱氧核苷酸的聚合。和Taq酶不同，Pfu酶有3至5的外切酶活性(proofreading activity)。另外，Pfu酶有5至3外切酶活性，但Pfu酶没有反转录酶活性。由于Pfu酶有3至5的外切酶活性，因此在PCR扩增过程中出错的几率大大降低，出错率为2.610-6 per nt per cycle。Pfu的出错率不仅远远低于Taq酶，也低于一些其它的高保真DNA聚合酶例如Vent、DeepVent、Pwo、Tli等，因此Pfu酶通常作为首先的高保真DNA聚合酶。 来源：本Pfu DNA Polymerase为recombinant Pfu DNA Polymerase，通过大肠杆菌表达纯化获得，和纯化获得的天然Pfu DNA Polymerase在各方面的性质相同。用途：高保真PCR (high fidelity PCR)、点突变、双平端PCR克隆等。Pfu酶扩增出来的DNA片断为双平端，可以用于双平端克隆，但不能用于常规的T载体克隆。dUTP和dITP或含有dUTP和dITP的引物不能用于Pfu酶介导的PCR扩增反应。活性定义：One unit of the enzyme catalyzes the incorporation of 10 nmol of deoxyribonucleotides into a polynucleotide fraction(adsorbed on DE-81)in 30 min at 72. Enzyme activity is assayed in the following mixture: 20 mM Tris-HCl(pH 8.8 at 25), 2 mM MgSO4, 10 mM (NH4)2SO4, 10 mM KCl, 0.1% (v/v)Triton X-100, 0.1 mg/ml BSA, 0.75 mM activated calf thymus DNA, 0.2 mM of each dNTP, 0.4 MBq/ml 3H-dTTP.纯度：不含DNA内切酶、外切酶和磷酸酯酶，不含RNA酶，满足常规PCR反应要求。酶储存溶液：20 mM Tris-HCl(pH 8.2), 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 100 mM KCl, 0.1% (v/v) Nonidet P40, 0.1% (v/v) Tween 20 and 50% (v/v) glycerol。10Pfu Buffer(with Mg2+)：200 mM Tris-HCl(pH 8.8 at 25), 100 mM (NH4)2SO4, 100 mM KCl, 1% (v/v) Triton X-100, 1 mg/ml BSA.。失活或抑制：酚氯仿抽提可以使Pfu酶失活。 包装清单：产品编号 产品名称 包装 D7216-1 Pfu DNA Polymerase(5U/l) 100U D7216-210Pfu Buffer(with Mg2+)0.5ml 说明书 1份 保存条件：-20保存。注意事项： 由于PCR反应非常灵敏可以扩增目的基因序列超过1000万倍，在使用Pfu酶时请注意避免微量待扩增DNA的污染，并尽量考虑设置不加模板的空白对照以确认是否有待扩增DNA的污染。Pfu DNA polymerase在扩增DNA片断时的出错率非常低，但其扩增效率也比较低。对于出错率要求不高的情况，例如RT-PCR进行定量或半定量，推荐使用Taq DNA p