2实验二生防菌的纯化和鉴定.ppt

实验二生防菌的纯化和鉴定一 实验目的学习放线菌 酵母菌的纯化培养 制片与鉴定方法 观察放线菌的细胞形态和菌落特征 认识酵母菌的菌落特征 并观察酵母菌的形态及生殖方式 二 实验原理从分离培养好的生防菌培养 挑取单个菌落 转接到新的纯化培养基上 每个单菌落划线接种 共挑取3个菌落 或划线涂于斜面试管中培养保存 三 实验材料1 实验材料 放线菌 酵母菌菌株 2 试剂 高氏一号培养基 无菌水 石炭酸复红染液 路哥氏碘液 70 酒精等 3 实验用具与仪器 无菌培养皿 盖玻片 载玻片 接种环 三角玻璃棒 酒精灯 微波炉 显微镜 四 实验步骤 一 单菌落 单孢分离方法1 制作高氏1号平板2 制作不同浓度的孢子悬浮液选出现5 20个菌落的皿挑取单孢菌落 制备孢子悬浮液 3 划线接种挑取单个菌落 转接到新的纯化培养基上 每个单菌落划线接种1个皿 或划线涂接于斜面试管中培养保存 单菌落 纯化培养基 纯化培养基 斜面试管 形态学观察培养特征生理生化特征 生防菌的鉴定内容 明胶液化牛奶凝固与胨化淀粉酶的活性纤维素生长试验硫化氢试验碳源的利用 普通显微镜观察透射电镜 菌落特征的观察 放线菌按培养特征和形态特征鉴定培养特征指标 孢子丝与孢子 即孢子堆 的颜色 气生菌丝 即形成孢子前 的颜色 基内菌丝的颜色 正面与背面 可溶性色素的颜色 除了观察上述色泽外 还观察菌落的特征 如菌落表面呈现的形状 干燥或湿润 气味 菌落的大小 气生菌丝的形状 有无同心环及菌落生长程度 形态特征指标 孢子丝的形状 孢子的形态及排列方式 二 放线菌形态特征的观察方法 插片法 1 培养基的制作 高氏1号 PDA 马铃薯200g 琼脂10g 葡萄糖20g 水1000ml 2 插片制作 a 试管斜面培养的放线菌中加入少许无菌水 或者用接种环挑取菌体少许放入无菌水中制成孢子悬浮液 b 用无菌吸管吸取孢子悬浮液1滴 加入高氏1号平板培养基上 用无菌刮铲涂抹均匀 c 将灭菌的盖玻片 以45度角插入培养基中 d 置于28 30 下培养4 5d 3 制片 用镊子取插片一张 吸水纸擦去生长较差一面的菌丝体 然后用镊子夹住盖玻片 使有菌面朝上 通过灯焰2 3次进行加热固定 冷却 4 染色 在盖玻片上滴加1滴石炭酸复红染色1分钟 水洗 干燥 5 镜检 取干净载玻片一张 盖片染色面向下放在载玻片上 依次在低倍镜 高倍镜 油镜下观察 辨认放线菌的菌丝体 孢子丝及孢子的形态及排列方式 宜用略暗光线观察 石炭酸复红染色液配方 碱性复红 Basicfuchsin 0 3g 95 酒精10ml 石炭酸 phenolcrgstalsC P 5g 蒸溜水95ml 将碱性复红溶解在95 酒精中 石炭酸溶于蒸溜水中 两溶液混合即成 酵母菌形态及特征的观察1 制片 取一干净的载玻片 滴加路哥氏碘液1滴 在超净工作台里用接种环取分离的纯种菌少许 加入碘液中混匀 加盖玻片 待用 2 镜检 方法同上 观察酵母菌的细胞形态及生殖方式 3 菌落观察 仔细观察平板培养基上的孤立菌落 记载所观察酵母菌种类的菌落特征 注意 1 加盖玻片时 以一边先接触液体 勿使产生气泡 2 用完油镜后一定要将镜头上的油擦干净 五 实验结果的观察记录1 放线菌菌落特征 菌落特征 圆形 较小 干燥 质地致密 表面粉粒状或绒毛状 有呈同心环或辐射状 皿内菌丝与培养基紧密结合 用针难以挑取 菌丝体与孢子常具不同色素 故菌落正面和背面可显示相应颜色 有的种类可散发特殊气味 形态特征 菌丝体成分枝丝状 发达 孢子有球形 椭圆形 杆状或瓜子型等 常呈串排列或单个存在 2 酵母菌菌落特征 菌落特征一般为圆形 表面光滑 湿润 粘稠 用针易挑取 具油脂光泽 多数种为白色 少数为红色 形态特征 单细胞 细胞圆形 椭圆形或圆柱形状 较细菌细胞大 具明显的细胞核和肝糖粒 脂肪粒等內含物 链霉菌myctinomycetes 属于链霉菌属 Streptomyces 粉红孢类群 Roseoporus 弗氏亚群亚群 Fradiae 链霉菌属 Streptomyces 蓝色亚群 Gyaneus 链霉菌属 Streptomyces 黄色亚群 Flavus 菌落形态 菌落边缘菌丝 产孢子形态 灰霉菌 根霉菌 毛霉菌 毛霉菌 青霉菌 玉米青霉穗腐病 青霉菌的帚状分生孢子梗和分生孢子 苹果青霉病菌 青霉菌的分枝状分生孢子梗和分生孢子 柑橘青霉菌 哈茨木霉 T harzianum 绿木霉 T virid Trichodermaviridefungusgrowingonsurfaceofsouthernyellowpinewood 二 内容 材料和方法 卵菌纲 Oomycetes 霜霉目 Peronosporales 疫霉属 Phytophthora 单轴霉属 Plasmopara 霜霉属 Peronospora 假霜霉属 Pseudoperonospora 盘梗霉属 Bremia 白锈菌属 Albugo 1 腐霉属 Pythium 观察蔬菜幼苗猝倒病标本 注意受害部位和症状特点 将瓜果腐霉 P aphanidermatum 斜面菌种的菌落少许移置在清水中 在18 20 下培养24 36小时 然后用解剖针从水中挑取少量菌丝制片镜检 观察菌丝有没有隔膜 游动孢子囊形状 与菌丝差别是否明显 能否看到孢子囊萌发的情景 泄管和泡囊的形态如何 孢子囊梗与菌丝无区别 孢子囊呈袋状 有的呈袋状叶瓣状 成熟时不脱落 萌发时形成泡囊 由泡囊产生游动孢子 有性产生一个卵孢子 2 疫霉属 Phytophthora 取马铃薯晚疫病 P infestans 标本 观察受害部位 注意症状特点 特别要注意叶片上病斑的位置 大小 状态 颜色 边缘是否清楚 是否产生灰白色的霉层 特别是叶背面 挑取马铃薯晚疫病菌斜面培养菌制片镜检游动孢囊梗 游动孢子囊和游动孢子 注意孢囊梗分枝的特点及游动孢子囊的形态 孢囊梗和菌丝有区别或没区别 即使有区别 也很少 能继续生长 游动孢子囊柠檬形 椭圆形 卵形 代表 马铃薯晚疫病 番茄疫病 P infestans 瓜果疫霉 3 单轴霉属 Plasmopara 观察葡萄霜霉病 P viticola 标本 注意为害部位及症状特点 挑取葡萄霉病病叶病斑上的霉层制片镜检孢子囊梗的形态 注意分枝特点及分枝末端的特征 也称直梗霉属孢囊梗单轴直角分枝 分枝末端平钝 葡萄霜霉病 P viticola 4 霜霉属 Peronospora 观察十字花科霜霉病 P parasitica 和大豆霜霉病 P manschurica 标本 注意为害部位的症状和特点 然后挑取少许霉层制片镜检孢囊梗和孢子囊 注意孢子囊的梗分枝特点 孢囊梗二叉状锐角分枝 末端尖细 萌发形成芽管 白菜霜霉病 波菜霜霉病 5 假霜霉属 Pseudoperonospora 观察黄瓜霜霉病 P cubensis 标本 注意为害部位和病状特点 挑取霉层制片镜检孢囊梗和孢子囊 注意孢囊梗的分枝特点 与霜霉属形态有何异同 孢子囊梗主干单轴分枝 然后作2 3回不完全对称的二叉状锐角分枝 末端尖细 主要寄生葫芦科植物黄瓜霜霉病P cubensis 6 盘梗霉属 Bremia 观察莴苣霜霜霉病 B lacrucae 标本 注意症状特点 挑取病叶上的霉层制片 镜检孢子囊梗的形态 注意分枝末端是否膨大呈盘状 边缘是否有小梗 孢子囊的形态及着生位置如何 孢囊梗二叉状锐角分枝 末端膨大呈盘状 寄生菊科植物莴苣霜霉病 B lactucae 7 白锈菌属 Albugo 取十字花科白锈病 A candida 注意受害部位 症状特点 切取白锈病病叶制片镜检注意孢子囊梗着生的位置 形态和排列特点 孢子囊的形态 注意观察藏卵器内卵孢子的数目 藏卵器壁与卵孢子壁是否愈合 孢子囊梗棍棒形 平行排列在寄主表皮下 游动孢子囊串生 扁球状 在叶背表皮下寄生 形成白瓷状物 卵孢子单生在寄主细胞 寄生十字花科 苋科 引致白锈病 二 内容 材料和方法 冬孢菌纲的锈菌目和黑粉菌目寄生性较强 与植物病害关系密切 冬孢菌纲真菌一般认为是低等担子菌 没有担子果 形成分散或成堆的冬孢子 半知菌的分类主要是根据无性阶段 分生孢子阶段 的形态特征 分为三个纲 芽孢纲 Blastomycetes 丝孢纲 Hyphomycetes 和腔孢纲 Coelomycetes 1 单胞锈菌属 Uromyces 冬孢子有柄 单细胞 顶壁较厚 突破寄主表皮生于体外 取菜豆锈病 U appendiculatus 病叶和病荚标本观察夏孢子堆和冬孢子堆的大小 颜色 是否穿破表皮 用解剖针挑取病叶上的冬孢子制片镜检 注意该属锈菌的形态特征 2 黑粉菌属 Ustilago 冬孢子堆粉状 彼此分离 孢子堆外没有由菌丝构成的假膜包围 冬孢子表面光滑或有纹饰 观察小麦散黑穗病 U tritici 玉米瘤黑粉病 U maydis 和谷子粒黑穗病 U crameri 的标本 注意受害部位及症状特点 取小麦散黑穗病菌制片镜检冬孢子及冬孢子萌发的形态 3 突脐蠕孢属 Exserohilum 观察玉米大斑病 E turcicum 标本 注意症状特点 挑取玉米大斑病病斑上的霉层制片镜检分生孢子梗和分生孢子的形态 分生孢子梗与内脐蠕孢属相似 分生孢子梭形 圆筒形或纺锤形 榄褐色 具假隔膜 脐点明显突出于基细胞外 从两端细胞萌发伸出芽管 有性态是刺球腔菌属 Setosphaeria 4 假尾孢属Pseudocercospora 菌丝埋生 与表生兼备 表面菌丝不缠结成菌丛 子座不发达 分生孢子单生 基部锥形平截 顶部常有喙 分生孢子梗丛生 弯曲 不分枝或分枝 产孢细胞无明显疤痕而具细齿 5 梨锈病 病原菌GymnosporangiumharaeanumSyd 属担子菌锈菌目胶锈菌属 其转主寄主是桧柏属植物 侵染叶片后 在叶片正面表现为橙色 近圆形病斑 病斑略凹陷 斑上密生黄色针头状小点 为病菌性孢子器 斑上溢出黄色黏液为病原菌性孢子 叶背面病斑略突起 后期长出黄褐色毛状物 为病原菌锈子器 成熟后锈子器顶端破裂 散出黄褐色粉状物为病菌锈孢子 子囊菌亚门 Ascomycotina 主要依据有性阶段子囊果的特征 子囊菌亚门分6个纲 1 半子囊菌纲 无子囊果 子囊裸生2 不整囊菌纲 闭囊壳 子囊散生 子囊孢子成熟后子囊壁消解3 核菌纲 子囊生在有孔口子囊壳内 或子囊整齐排列在无空口的闭囊壳基部4 腔菌纲 子囊座 子囊双层壁5 盘菌纲 子囊盘6 虫囊菌纲 子囊壳 无菌丝体 均为节肢动物外寄生菌 一 半子囊菌纲Hemiascomycetes 1 不形成子囊果 2 无性繁殖 产生分生孢子 较低等 营养体裂殖或芽殖产生 有的子囊孢子芽殖 3 有性生殖 产生子囊 子囊单生 游离 有的子囊可以并列成排 无子囊果 全裸生 子囊单层壁 子囊不是由产囊丝形成 而是菌丝相溶形成 4 分三个目 与植病有关的仅外囊菌目 一个属 外囊菌属Taphrina 子囊长圆筒形 平行排列在寄主表面 不形成子囊果 子囊孢子芽殖产生分生孢子 均为植物专性寄生菌 人工培养基上不能培养 造成畸形 代表病害 桃树缩叶病 Taphrinadeformans 二 不整囊菌纲Plectomycetes 有性世代自然界很少发生 仅包括一目 散囊菌目Eutotiales 是产生子囊果中最低等的类型 特点 1 子囊散生在闭囊壳里 2 闭囊壳壁发育不一致 有的疏松 有的较厚 3 子囊圆或椭圆形 4 子囊壁早期溶解 在子囊孢子成熟前 5 有性世代不易发现 无性世代很发达 多为害产后的果品 如意大利青霉 三 核菌纲 Pyrenomycetes 是子囊菌中最大一个纲 包括很多重要植物病原菌 共同点 形成闭囊壳或子囊壳 子囊不溶解 子囊单层壁 有性和无性都很发达 共分4个目 1 白粉菌目 闭囊壳 菌丝白色 专性寄生 子囊孢子单胞无色 2 球壳菌目 子囊壳 子囊单层壁 3 小煤炱目 闭囊壳 菌丝暗色 专性寄生 子囊孢子多胞暗色 4 冠囊菌目 闭囊壳 非专性寄生 与植病无关 一 白粉菌目 Eryshiphales 1 白粉菌目的真菌一般称作白粉菌 引致各种植物白粉病 Powdery mildew 2 菌丝白色 大都表生 产生吸器吸取植物营养 3 主要寄生在叶片上 有的发生在新梢或芽上 在病部形成白粉或小黑点 4 无性世代 非常发达 由菌丝形成分生孢子梗和分生孢子 分生孢子链生或单生 不断产生 形成白粉 5 有性世代 寄生后期在菌丝的上部形成闭囊壳 小黑点 有附属丝 便于传播 闭囊壳内有一个或多个子囊 子囊内有2 8个子囊孢子 子囊孢子单胞无色 CommonPowderyMildewGenera Phyllactinia Microsphaera Uncinula Erysiphe Podosphaera Sphaerotheca 布氏白粉属Blumeria 附属丝不发达 短菌丝状 闭囊壳内含多个子囊 分生孢子梗基部膨大 代表 禾本科植物白粉病 B graminis 叉丝壳属Microsphaera 附属丝顶端多轮二叉状分枝 闭囊壳内多个子囊 代表 核桃白粉 丁香白粉 榛树白粉病 叉丝单囊壳属Podosphaera 附属丝刚直 顶端多轮二叉状分枝 闭囊壳内仅有一个子囊 苹果白粉病 桃树白粉病 山楂白粉病 钩丝壳属Uncinula 附属丝顶端卷曲呈钩状 闭囊壳内子囊多个 代表 葡萄白粉病U necator 球针壳属Phyllactinia 附属丝球针状 基部半球形 闭囊壳内子囊多个 代表 梨树白粉病 二 小煤炱目Meliolales 形态与白粉菌相似 是植物体外寄生菌 专性寄生 有生理分化现象 子囊果是闭囊壳 为害在叶表面附着 影响光合作用 1 菌体暗色或灰色 2 子囊孢子多胞 2 5 暗色 3 不产生任何无性世代 4 分布热带或亚热带的雨林中 或暖温带 1个科 代表 小煤炱属 Meliola 荔枝煤烟病 三 球壳目 Sphaeriales 1 核菌纲最大的目 大约5000种313属 占子囊菌的1 3 2 寄生性 多为腐生菌 也有很多重要的寄生菌 如苹果树腐烂病 甘薯黑疤病等 还包括寄生昆虫的名贵药材冬虫夏草 Cordycepspurpurea 等 3 子囊果为典型的子囊壳 通常为球形 或瓶形 大多有颈和孔口 4 子囊多为棍棒形或圆筒形 单层壁 排列成子实层或不规则地散生在不同高度 有或无侧丝 或侧丝早期消解 5 假子座 菌丝体和植物组织混合在一起形成的子座 长喙壳属Ceratocystis 长喙壳菌科子囊壳有长颈 子囊壁早期溶解 子囊孢子单胞无色 多为钢盔形 有的为扁圆形 成熟随粘液从孔口流出 由昆虫传播 代表 甘薯黑疤病 赤霉属 Gibberella 肉座菌科子囊壳单生或群生在肉质的子座上 子囊壳壁蓝色或紫色 子囊棒状有柄 子囊孢子多胞纺缍形 无色 无性世代为镰刀菌属Fusarium 代表 水稻恶苗病 玉米赤霉菌G zeae引起大麦 小麦 玉米赤霉病 形成白穗 红穗 小丛壳属Glomerella 疔座菌科子囊壳小 球形 半埋生在子座内 子囊棍棒状 无侧丝 子囊孢子单孢无色 长椭圆形 稍弯曲 有性世代在自然界很少发生 无性世代为炭疽菌属 Colletotrichum 棉花炭疽病G gossypii 苹果梨炭疽病G cingulata 黑腐皮壳属Valsa 间座壳科子囊壳埋生子座基部 有长颈伸出子座 子囊孢子腊肠状 单胞无色或暗色 无性世代是壳囊孢属 Cytospora 只能为害树皮 不能为害绿色部分 苹果树腐烂病 顶囊壳属Gaeumannomyces 间座壳科子囊壳埋生在子座基部 梨形或球形 黑色 顶端有短喙状突起 子囊圆柱形 有顶环 子囊孢子线形多胞 无性世代不发生 麦类 玉米全蚀病 Takeall 麦角菌属Claviceps 寄生于禾本科植物的小穗形成菌核 菌核落地越冬或越夏 下个生长季萌发 形成多个头状子座 鲜艳 在子座头部周围浅层形成一圈子囊壳 子囊壳瓶状 仅孔口露出 子囊孢子丝状 单胞无色 代表 禾本科植物麦角病 麦角就是菌核 对人畜有毒 止痛 止血 绿核菌属Ustilaginoidea 别名 拟黑粉菌属在稻粒上产生墨绿色的分生孢子座 其上产生厚垣孢子 秋后从分生孢子座上产生菌核 菌核萌发后产生子座 稻曲病 U virons 四 腔菌纲Loculoascomycetes 1 主要特征 子囊果是子囊座 单个子囊散生在子座组织中 或许多子囊成束或成排着生在子座内的子囊腔中 子囊双层壁 子囊孢子多数为多胞 有横隔或砖隔 2 子囊座 内生子囊的子座 子座组织溶解成子囊腔 内生子囊 子囊座有的垫状 块状 有的呈子囊壳形 瓶形 有口 子囊座中的产囊丝伸入正在发育过程的子座组织中 随着产囊丝发育 随后形成子囊腔 3 假囊壳 有的子囊座内只有一个子囊腔 外形似子囊壳 子囊腔内有的仅有一个子囊 多数有多个子囊 子囊有的并列 有的串生 子囊之间有拟侧丝 是由子座组织形成的剩余菌丝 有的无 4 子囊 子囊双层壁 有圆形 近圆形 棍棒形 外壁薄 坚硬无弹性 内壁厚有弹性 释放子囊孢子 5 腔菌纲分5个目 其中与植病有关的是多腔菌目 座囊菌目和隔孢腔目 一 多腔菌目Myriangiales 主要特征是子囊座内有多个子囊腔 每个腔内仅有一个子囊 子囊圆形或近圆形 子囊孢子多孢 子囊座表生或半埋生 形态多种多样 垫状 块状 球形 本目有一百个种左右 主要分布在热带和亚热带 多为腐生 少数寄生 可寄生在植物和昆虫 介壳虫 上 只介绍一个属 痂囊腔菌属 痂囊腔菌属Elsinoe 多腔菌科子囊在子囊腔中不规则散生 每个子囊腔只有一个球形子囊 子囊孢子长圆筒形 3隔4胞 无色 为害植物主要是无性世代 在分生孢子盘上产生分生孢子 痂圆孢属Sphaceloma 我国有性世代未发现 主要无性 代表 葡萄黑痘病 二 座囊菌目Dothideales 1 子囊束生在具有多个子囊腔的子囊座或假囊壳内 子囊倒棍棒形或短圆筒形 双层壁 没有拟侧丝 2 多为腐生 少数为植物病原菌 引致叶斑 腐烂 产生霉状物或小黑点 3 共8个科 与植病有关仅一科 座囊菌科 球座菌属Guignardia 本属与上属形态基本一致 本属子囊孢子单胞 假双孢 无性世代很发达 包括在叶点菌属和茎点菌属 葡萄黑腐病菌G biwellii葡萄房枯病菌G baccae 三 格孢腔目Pleaporales 1 子囊座内为单个子囊腔 假囊壳 子囊之间有拟侧丝 子囊长圆柱形 子囊孢子常见的多为隔或砖隔 2 腐生或寄生 寄生在茎或叶片上 有些是重要的植物病原菌 黑星菌属Venturia 1 假子囊壳很小 表面生有刚毛 埋生或表生 子囊孢子椭圆形 双胞大小不等 淡色 个别褐色 可为害植物叶片和果实 无性黑星孢Fusicladium2 代表病害 梨黑星病V pirina苹果黑星病V inaequelis检疫性病害 五 盘菌纲Discomycetes 1 子囊果为子囊盘 apothecium 典型的子囊盘呈盘状或杯状 有柄 子实层由排列整齐的子囊和侧丝组成 2 大多数盘菌无性阶段不重要 甚至不发生 3 盘菌纲分为7个目 大多为腐生菌 如羊肚菌 与植物病害有关的只有星裂菌目和柔膜菌目 核盘菌属Sclerotinia 菌丝体可以形成菌核 真菌核和假菌核 菌核萌发后可形成长柄子囊盘 子囊棍棒状 平行排列 有拟侧丝 子囊孢子椭圆形或仿缍形 单胞无色 无性世代不发生 寄主范围很广 可侵染32科160多种植物 代表 油菜 向日葵菌核病 细菌染色法 染色还有助于检测细菌细胞的一些结构和生理特点 可以用于鉴别细菌种类 正染色 染料与细胞结合而进行染色的过程 负染色 细胞不染色而使背景染色的过程 多用于荚膜的观察 染色 细菌细胞小而透明 为便于观察必须增加反差 因此要对细菌进行染色 步骤 结果 阳性菌 紫色阴性菌 红色 由丹麦医生HansChristianGram于1884年创立 革兰氏染色法 GramStain 革兰氏染色有着十分重要的理论与实践意义 通过这一染色 几乎可把所有的细菌分成革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌两个大类 因此它是分类鉴定菌种时的重要指标 又由于这两大类细菌在细胞结构 成分 形态 生理 生化 遗传 免疫 生态和药物敏感性等方面都呈现出明显的差异 因此任何细菌只要通过简单的革兰氏染色 就可提供不少其他重要的生物学 三 细菌的细胞结构 细菌的细胞结构分为基本结构和特殊结构 基本结构指一般细菌都有的结构 例如细胞壁 细胞膜 细胞质 核质体和内含物等 特殊结构指某些细菌在生长的特定阶段所形成的结构 例如 芽孢 鞭毛和荚膜等 细菌细胞壁的化学组成 革兰氏阳性细菌与革兰氏阴性细菌细胞壁成分比较 概念 肽聚糖是由N 乙酰胞壁酸 NAM 和N 乙酰葡糖胺 NAG 以及短肽链 主要是四肽 组成的亚单位聚合而成的大分子聚合物 细胞壁的基本骨架 肽聚糖 共有成分 革兰氏阳性细菌细胞壁 革兰氏阳性细菌细胞壁具有较厚 30 40nm 而致密的肽聚糖层 多达20层 占细胞壁的成分60 90 它同细胞膜的外层紧密相连 有的革兰氏阳性细菌细胞壁中含有磷