3、2菊花的组织培养.ppt

课题1菊花的组织培养 专题3 植物的组织培养技术 课题目标 1 说明植物组织培养的基本原理 2 学习植物组织培养的基本技术 3 进行菊花或其他植物的组织培养 课题重点 难点重点 植物组织培养过程中使用的无菌技术 难点 植物组织培养过程中使用的无菌技术 一 基础知识 一 植物组织培养的过程 二 影响植物组织培养的因素 1 细胞分化 在植物的个体发育中 细胞在形态 结构和生理功能上出现稳定性差异的过程 特点 1 稳定性 已分化的细胞在结构和功能上都比较专一 离体条件下发育成完整植株并不容易 一般不能再进行分裂和分化 2 持久性 细胞分化将伴随着生命活动的进行一直进行 一 植物组织培养的过程 2 脱分化 由高度分化的植物组织或细胞 在离体和营养 激素等培养条件下脱去分化状态 重新获得分裂分化能力 并形成愈伤组织的过程称为脱分化 又称去分化 特点 1 细胞的全能性升高 2 分化程度降低 3 分裂能力增强具有了重新发育成一个完整个体的能力 一 植物组织培养的过程 3 愈伤组织 由高度分化的植物组织或细胞 在离体和营养 激素等培养条件下培养一段时间 脱分化和分裂重新形成的具有分裂和分化能力的植物组织叫做愈伤组织 特点 1 排列疏松无规则 2 高度液泡化的无定形薄壁细胞 3 具有重新分裂分化的能力 一 植物组织培养的过程 4 再分化 脱分化产生的愈伤组织在适宜的条件 适宜的营养 激素和温度 光照的 下继续培养 重新分化形成根或芽等器官的过程叫再分化 特点 1 全能性逐渐降低 2 分化程度逐渐升高结果是重新形成植物体的各种组织 器官 最后形成试管苗 试管苗移栽后发育成完整的植物体 一 植物组织培养的过程 组织培养的整个过程需要通过植物激素等培养条件的控制 人为控制细胞的脱分化和再分化 一 植物组织培养的过程 1 外植体取材 1 不同植物的组织培养难度差别很大 如 烟草和胡萝卜组织培养较为容易 枸杞愈伤组织的芽诱导就比较难 不同种植物材料的选择直接关系到实验的成败 2 外植体的生理状态会影响实验结果材料年龄 保存时间长短也会影响实验结果 如菊花的组织培养一般选择未开花的植株茎上部新萌生的侧枝 代谢旺盛 幼嫩组织容易脱分化和培养 代谢缓慢 老化的组织不易脱分化和培养 二 影响植物组织培养的因素 2 培养基 培养基离体的植物组织和细胞 对营养 环境等条件的要求相对特殊 需要配制适宜的培养基 常用的是 培养基 培养基的主要成分 1 大量元素 N P S K Ga Mg 2 微量元素 Fe Mn Cu Zn B Mo I Co 3 有机物 如甘氨酸 烟酸 肌醇 维生素及蔗糖等 4 植物激素 生长素 细胞分裂素 赤霉素等 二 影响植物组织培养的因素 旁栏思考 你能说出各种营养物质的作用吗 同专题2中微生物培养基配方相比 MS培养基的配方有哪些明显不同 1 MS培养基 无机盐 大量元素和微量元素 碳源 蔗糖提供碳源并维持渗透压 特殊营养 甘氨酸 维生素等主要是满足离体细胞正常代谢途径受到影响后的特殊营养需求 在MS培养基的基础上经常加入植物激素 2 微生物培养基 以有机营养为主 3 植物激素 配制好的MS培养基常需添加植物激素 1 常见的植物激素及其在组织培养中的作用 生长素类 功能 诱导细胞分裂和根的分化 在生长素存在的情况下 对细胞分裂素的作用呈加强趋势 常用的有 吲哚乙酸 IAA IBA 吲哚 3 丁酸 萘乙酸 NAA 2 4 二氯苯氧乙酸 2 4 D 其中 IBA和NAA广泛引用于诱导分化生根 2 4 D常用于愈伤组织的诱导和生长 但趋向于抑制植物形态的发生 所以在分化培养基中很少利用 二 影响植物组织培养的因素 二 影响植物组织培养的因素 细胞分裂素类 功能 主要作用是促进细胞分裂或从愈伤组织和器官上分化出不定芽 常用的有 激动素 KT 6 苄基嘌呤 6 BA 玉米素 ZT 其中 6 BA一般用于诱导愈伤组织分化出丛芽 KT加速细胞分裂 加快培养物生长速度 赤霉素类 赤霉酸 GA3 等功能 刺激细胞伸长 一般用来刺激分化的丛芽或小植株快速长高 特点 高温下极易降解 一般是在过滤除菌后再加入到已高温灭菌的培养基中 生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂 脱分化和再分化的关键性激素 按照不同顺序得到不同结果 二 影响植物组织培养的因素 2 不同使用顺序的结果 两种激素共同使用时 两者用量比例影响细胞发育方向称作 激素杠杆 但是要考虑内源激素的含量 可见激素的浓度 顺序 用量比例等都会影响实验结果 植物激素应用要得心应手还需大量实践 3 生长素和细胞分裂素比例对发育方向的影响 4 其他培养条件 如PH 温度 光照 无菌等条件除上述因素外PH 温度 光照等条件也很重要 不同植物对各种条件的要求往往不同 如进行菊花组织培养 5 8左右 温度 18 22 光照 每天日光灯照射12h 二 影响植物组织培养的因素 二 实验操作 一 制备MS固体培养基 二 外植体接种 三 接种 四 培养 五 移栽 六 栽培 培养基配方 配制1000ml用于组织培养 一 制备MS培养基 螯合铁盐的配制 取5 57gFeSO4 7H2O和7 45gNa2EDTA 溶于1L蒸馏水中 制成铁盐母液 配制1L培养基 取螯合铁盐母液5ml 1 配制各种母液 MS培养基含20多种营养成分 实验室一般使用4 保存的配制好的培养基母液来制备 1 无机物 常温保存 大量元素 浓缩10倍 微量元素 浓缩100倍 2 激素类 维生素类以及用量较小的有机物 一般可按1mg ml的质量浓度单独配制成母液用母液配制培养基需根据各种母液的浓缩倍数计算用量 一 制备MS培养基 2 配制培养基 配制1L 培养基时 将称好的琼脂加入800ml蒸馏水加热溶化 2 加蔗糖30g 3 取配好的大量元素 微量元素 有机物和植物激素母液依次加入 加蒸馏水定容至1000ml 调PH 4 分装到锥形瓶 每瓶分装50ml或100ml 5 植物激素 由于菊花茎段组织培养较容易 因此不必添加植物激素 3 灭菌 分装好的培养基同其他器械一起高压蒸汽灭菌 一 制备MS培养基 1 取 外植体 生长旺盛的菊花茎段嫩枝 流水冲洗2 可加少许洗衣粉 软刷刷洗后 流水冲洗20min左右 无菌吸水纸吸干表面水分3 放入体积分数70 的酒精中摇动2 3次 持续6 7s 立即取出 在无菌水中冲洗 无菌吸水纸吸干表面水分4 放入质量分数为0 1 的氯化汞溶液中1 2min 取出后在无菌水中至少清洗三次 漂净消毒液注意 消毒时既要考虑消毒效果又要考虑植物的耐受能力 二 外植体消毒 二 外植体消毒 外植体 流水冲洗 洗衣粉 软刷刷洗 流水冲洗20min 吸干表面水分 70 的酒精 无菌水中冲洗 吸干表面水分 0 1 的氯化汞 无菌水中至少清洗三次 漂净消毒液 接种前准备 体积分数70 的酒精擦拭工作台进行消毒后 点燃酒精灯 接种操作都必须在酒精灯旁进行 每次使用器械后都需要火焰灼烧灭菌1 培养基整齐的排列在酒精灯左侧 将消过毒的菊花茎段在无菌培养皿中切成小段 长约0 5 1cm 2 左手持瓶 右手拉开捆绳 将封口膜攥于右手心 以免接触瓶口的内侧面被污染 左手让瓶口旋转过火焰3 右手用镊子夹取菊花茎段插入培养基 注意方向 不要倒插 每瓶6 8个外植体4 接种后将封口膜重新扎好 三 接种 1 接种后锥形瓶最好放在无菌培养箱中培养2 培养期间定期消毒3 温度 18 22 4 每天日光灯照射12h 四 培养 1 移栽生根试管苗前 打开封口膜在培养间生长几日2 流水清洗根部培养基 移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境下生活一段时间 3 等幼苗长壮后移栽到土壤中 五 移栽 移栽后每天观察记录生长情况 适时浇水 施肥直至开花 六 栽培 1 培养基的灭菌 高压蒸汽灭菌2 外植体的消毒 酒精 氯化汞3 接种的无菌操作 酒精 灼烧灭菌4 培养 无菌箱中的培养5 移栽到消毒的环境中生存一段时间 注意 在整个操作过程中要无菌操作 制备MS固体培养基 外植体消毒 接种 培养 栽培 移栽 冲洗 酒精 无菌水冲洗 氯化汞 无菌水冲洗至少三次之上 实验操作流程 旁栏思考 你打算做几个重复组 你打算设置对照实验吗 每种材料或配方至少需要做一组以上的重复 用经灭菌而未接种的空白培养基锥形瓶与接种后的锥形瓶一同培养 用以证明培养基未被污染 三 结果分析与评价 1 接种3 4d后 观察外植体的生长情况 统计有多少外植体被污染 有多少能正常生长 分析外植体被污染的原因 接种3 4d后 操作中被污染的培养物会表现出污染现象2 是否完成了对植物组织的脱分化和再分化是否出现愈伤组织 多长时间出现愈伤组织 统计更换培养基后愈伤组织进一步分化成根和芽的比例和时间 三 结果分析与评价 3 是否进行了统计 对照与记录做好统计和对照 填好结果记录表 培养严谨的科学态度 可分组配制不同培养基 如诱导愈伤组织或直接分化出丛芽的培养基 然后做不同配方的比较 4 生根苗的移栽是否合格移栽的关键是充分清洗根部的培养基 又不伤及根系 一般用无土栽培的方法 培养基质提前消毒 可用质量分数为5 的高锰酸钾溶液 新移栽的组培苗要在温室过渡几天 等壮苗后再移植到大田或盆栽 可统计移栽成活率 看看是否合格 四 课题延伸 1 一般来说 容易进行无性生殖的植物也容易进行组织培养 如芦荟 豆瓣绿 秋海棠 月季等 你可以从中挑选一种你喜欢的植物 进行组织培养 2 如对植物激素的作用感兴趣 可在查阅资料的基础上 探究生长素与细胞分裂素使用比例对植物组织培养的影响 例如 你可以设计一组对照试验 分别探究不加任何激素 生长素与细胞分裂素的用量比值为一 比值大于一以及小于一时 对实验结果的影响 1 答 植物组织培养所利用的植物材料体积小 抗性差 对培养条件的要求较高 用于植物组织培养的培养基同样适合于某些微生物的生长 如一些细菌 真菌等的生长 而培养物一旦受到微生物的污染 就会导致实验前功尽弃 因此要进行严格的无菌操作 2 答 外植体的生理