SILAC定量技术方案.doc

SILAC定量技术方案一 样品制备1. 细胞培养和蛋白提取 (1). MEM培养基的准备(配制400 mL) 制备氨基酸储液：分别在20mL L-Arginine缺陷型MEM培养基中配置0.30mM(50%正常浓度)的13C6 L-Arginine hydrochloride和13C6, 15N4 L-Arginine hydrochloride储存液(均称取26 mg)，待充分溶解后，分别用0.22m的无菌滤器过滤。分别加入20mL除菌后的氨基酸储液、10%的透析胎牛血清、1%的青链霉素、2mM的L-Glutamine和2mM的丙酮酸钠并用缺陷型MEM培养基定容到400 mL，贮存于4C。每种完全培养基中的氨基酸浓度见表4-1：表4-1 MEM培养基中轻、中、重L-Arginine的浓度Cell linesAmino AcidsM. W.Culture MediaAmount(concentration)AL-Arginine174.2RPMI 1640241.9 mg/L (1.15mM)B13C6 L-Arginine 216.7MEM65.0 mg/L (0.3mM)C13C6, 15N4 L-Arginine 220.7MEM65.0 mg/L (0.3mM)(2). 细胞培养 将A、B、C三种细胞复苏后，分别接种于10cm培养皿中，在常规RPMI 1640培养基(添加10%的透析胎牛血清和1%的青链霉素)中培养HL-7702，分别使用仅含有13C6 L-Arginine hydrochloride和13C6, 15N4 L-Arginine hydrochloride 的MEM培养基培养B和C，经过5-6个细胞世代的培养后，将细胞数量扩增到107-108左右(5-6盘)。(3). 蛋白提取用500 l全细胞裂解液(50 mM Tris，pH 7.4；150mM NaCl；1%Triton-100；1mM AEBSF；20 l/g aprotinin；20l/g leupeptin)2. 蛋白质含量测定(1). 采用改进的Bradford法，将BSA分别稀释为从0-1.40mg/ml范围内若干浓度，待测样品稀释10倍、20倍，各取20L加80L0.12M HCl，轻轻混匀。(2). 各管再加入3.5ml过滤的稀释4倍的dye reagent，轻轻混匀，静置5min后测A595值。(3). 取A595值对BSA 标准浓度作标准曲线，再根据待测样品的A595值，从BSA标准曲线中确定其浓度。(4). 同位素标记样品与非标记样品按照蛋白含量1:1混合。3. SDS-PAGE分离和染色(1). 电泳条件：4%浓缩胶，12%分离胶;(2). 2SDS上样缓冲液的配制：2mL Tris-HCL buffer (0.5M, pH 6.8)；2 mL甘油；1mL巯基乙醇；4mL10%SDS溶液；适量水补足体积至10mL，混匀即得。(3). 电泳条件：4%浓缩胶，12%分离胶，先恒流10mA，运行时间0.5h，再于20mA运行至溴酚蓝前沿到达分离胶底部。(4). 胶体考马斯亮蓝染色方法如下：用10%甲醇，7%乙酸溶液固定30min，然后用胶体考马斯亮蓝溶液(0.12%G-250，10%硫酸铵，10%磷酸，20%甲醇)染色过夜，用蒸馏水或10%甲醇水溶液脱色，清洗胶数遍即可获得背景清晰的染色效果。4. 胶内酶解、肽段提取(1). 用干净的解剖刀将胶按照从高分子量到低分子量全覆盖切成3-4mm宽度的胶条，大约切成20个条带左右。然后将每个胶条切成1-2mm2大小的胶块。(2). 100 L 50%乙腈/25 mmol/L碳酸氢氨浸泡胶粒，超声10 min，弃去溶液，重复1-2次至胶粒的蓝色褪尽。(3). 真空离心干燥至胶粒完全脱水，加入10-15l 10ng/L的胰蛋白酶(25mmol/L碳酸氢铵溶解），4C冰箱放置30-40min，吸走多余酶液或补充25mM碳酸氢铵覆盖胶粒，37C保温18-20小时。(4). 80-100 l 5%TFA 40C提取1h，期间超声两次，取出上清。80-100l 2.5%TFA/50%ACN 30C提取1h，期间超声两次，合并上清，离心干燥。二 质谱分析与数据库检索1. LC-LTQ-FT分析1). 毛细管色谱系统在Agillent1100系统上进行，由自动上样器上样，上样体积为30l，上样流速为10l/min；色谱洗脱在由二元泵系统上进行，洗脱下来的组份经过ESI离子源直接进入质谱，液相色谱条件为：流动相A：0.1%FA-98%水溶液；流动相B：0.1%FA-80%ACN溶液。洗脱条件：0-90min，流动相比例由2%B线性升至40%B；90-105min，流动相比例由40%B线性升至100%B；维持15 min后，以100% 流动相A平衡色谱柱30min。流动相流速为300nL/min。2). 质谱仪为线性离子阱-傅里叶变换离子回旋共振质谱仪(LTQ-FT，Thermo Finnigan)，磁场强度为7特斯拉。雾化N2气流速(sheath gas)12 L/min；碰撞气为高纯氩气；喷雾电压(spray voltage)为3.2kV；毛细管温度(capillary temperature)为160C；毛细管电压(capillary voltage)为2.8kV。分析柱为PicoFritTM 反相柱(BioBasic C18, 5m, 75 m i.d. x 10cm, 15m i.d.spray tip, New Objective, Woburn, MA, USA)。一级质谱的数据依赖的二级质谱扫描模式(Data Dependent MS/MS Scan)；依次选取一级质谱中离子强度最强的5个离子进行CID二级串联质谱。采用串联质谱扫描的动态排除功能(dynamic exclusion)，设置排除时间为3min。离子自动增益控制设置为：一级质谱扫描为5105个电荷，二级串联质谱为1104个电荷。一级质谱的在m/z为400处的分辨率为100000。离子传输毛细管温度为200C；从电喷雾电压1.8KV。二级串联质谱母离子窗口为4Da，归一化碰撞能量为35%；质谱的一级全扫描质荷比范围是4002000(Mass range，m/z 400-2000)。三数据库检索1. 应用DTA supercharge将raw文件转成mgf文件(1). DTAsupercharge软件可以从网上下载,http:/ ,网站定期有版本更新。(2). 安装前需要安装Xcalibur，Bioworks，不同版本的DTAsupercharge对Xcalibur的版本要求不同。安装时若版本不符会有提示。安装Xcalibur时要安装XDK功能，见下图A. 还需要Microsoft .net Framework的支持（1.1或2.0，不同版本要求不同）B. 功能：把raw文件提出dta文件再合并成mgf文件。C. 界面如下：(3). 转换单个raw文件：DTA processing标签下，选择raw文件。然后点“Convert”菜单下的“Start Conversion”(4). 批量转换：把指定文件夹下所有的raw文件进行转换：automation菜单下选择“set parameters for processing several raw files”设定这些raw文件所在的文件夹。然后点“process raw files in folder”这样会把指定文件夹下所有的raw文件转换成dta和mgf文件。2. Mascot搜库使用Mascot检索合并好的mgf文件。设置检索参数：(1). 所用数据库；(2). 可变修饰设置为半胱氨酸烷基化修饰(+57.0214Da)，甲硫氨酸(Met)氧化(+15.99Da)，13C6 L-Arginine修饰(+6.02Da)，13C6, 15N4 L-Arginine修饰(+10.01Da)。(即将SILAC同位素的修饰设置为可变修饰)(3). 最大胰酶漏切位点为1个，一级母离子误差20ppm，二级碎片离子误差0.8Da。(4). 将搜库的网页结果以peptide summary的方式保存。(5). 这样每个mgf文件就得到1个html格式的搜库结果。四数据定量分析1. Mascot检索后的肽段定量分析是由MSQuant完成。2. 软件在/，网站定期更新，可下载最新版本。3. 软件安装与datasupercharge一样，需要在装Xcalibur时安装XDK功能，还需要Microsoft .net Framework的支持。4. 软件在使用时，将raw文件与其相对应的Mascot搜索结果html文件相关联(associated)。5. MSQuant定量软件的参数设置主界面示意图如下：蛋白Mascot打分卡值肽段Mascot打分卡值定量形式(一般用full scan定量)SILAC标记模式设置SILAC定量分析的参数：主要是设置肽段mascot打分卡值；SILAC定量标记同位素氨基酸模式；以及定量形式(定量形式一般采用full scan定量的形式)。设置完定量参数后可以进行定量分析了。6.定量分析主界面如下：定量质谱图保