分子生物学：基因突变2 研究生课件.ppt

Chapter11GeneMutation Section1BasicConceptofGeneMutation 任何因素引起基因组DNA分子一级结构的异常改变 并导致生物个体表型的改变 称为基因突变 genemutation 根据引起基因突变的原因 可将其分为自发突变 spontaneousmutation 和诱发突变 inducedmutation 根据发生基因突变的细胞的不同 可将其分为生殖细胞突变 germcellmutation 和体细胞突变 somaticmutation Section2ClassificationandCharacteristicsofGeneMutation 1 TypeofGeneMutation 主要根据DNA一级结构改变情况分类 可分为单点突变 singlepointmutation 和多点突变 multiplepointmutation 点突变的形式包括转换 transition 颠换 transversion 插入 insertion 缺失 deletion 等 1 1PointMutation 基因组DNA中插入了其他的DNA小片段 导致读码框改变或基因失活 1 2InsertionMutationofDNAFragment 基因组DNA中丢失了小片段DNA 导致读码框改变或基因失活 1 3DeletionMutationofDNAFragment DNA碱基改变后 形成相应的简并密码 其编码的多肽链氨基酸序列不发生改变 称为同义突变 2 ResultsofGeneMutation 2 1SynonymousMutation DNA碱基序列改变导致其编码的多肽链氨基酸序列改变 称为错义突变 错义突变后的编码产物仍然保留部分生物学活性 则称为渗漏突变 leakymutation 错义突变后的编码产物如能全部保留原有生物学活性 则称为中性突变 neutralmutation 2 2MissenceMutation DNA碱基序列改变而产生终止密码 导致多肽链非正常终止称为无义突变 2 3NonsenceMutation DNA碱基序列改变导致读码框的位移 使翻译的蛋白质成为无生物学活性的分子称为移码突变 2 4Frame shiftMutation 基因突变后 再经二次突变 其生物学功能完全恢复 称为回复突变 reversemutation 基因经第二次突变后 产生的突变效应只是对第一次突变的补偿 则称为校正抑制突变 suppressionmutation 3 ReverseofMutationEffects SuppressionMutationofarcGenefromPhageP22 基因组DNA分子中各部位发生的突变的机率不同 突变频率明显高于其他部位的突变区被称为突变热点 许多突变热点源于甲基化修饰的碱基 特别是发生于CpG岛 4 MutationHotspots 对于二倍体生物 决定其表型的某种生物活性物质的合成仅由一对等位基因控制 5 RelationshipofAllelesMutationwithPhenotype 5 1SingleAlleles 野生型纯合子 野生表型 突变型纯合子 突变表型 在一个基因座位上存在两个及以上的等位基因 每一对等位基因均有一定程度的变异 但这种变异对其功能没有影响 只是产生不同的表型 如决定某种颜色的等位基因 5 2MultipleAlleles 在某一种群基因组的座位上 存在多种不同的等位基因 从而决定不同的遗传表型 称为等位基因的遗传多态性 如决定ABO血型的等位基因 5 3AllelesPolymorphism 6 DynamicMutation 串联的三核苷酸重复拷贝数可随世代递增而出现累加效应的突变 称为动态突变 在多种神经变性疾病中都存在三核苷酸的不稳定扩展 其中以CAG重复扩展导致的疾病较多 CAG重复扩展序列在各自的编码基因中产生一段多聚谷氨酰胺链 RepeatExpansionMutation RepeatExpansionMutationofDystrophiaMyotonicaProteinKinaseGene Section3ResultsofGeneMutation 1 BiologicalEvolution 基因突变是生物进化的源泉 通过基因突变 可对现存基因进行改造 也可产生新的基因 2 GeneticDiseases 对于高等生物来说 有利的基因突变是很少的 因此 基因突变的后果常常是引起人类的遗传性疾病 目前已知人类有8000多种疾病与基因突变有关 包括镰刀状红细胞贫血 苯丙酮酸尿症等 3 CellCanceration 与癌症发生直接相关的基因包括癌基因和抑癌基因 各种物理的 化学的或生物的诱变剂可使这些基因发生突变 从而引起细胞癌变 Section4Site directedMutagenesis 对已克隆基因或DNA片段中的任何一个特定碱基 在体外条件下人工诱发碱基的取代 插入或缺失变化的过程称为基因的定点诱变技术 定点诱变技术是进行基因工程和蛋白质工程的重要手段 1 Site directedMutagenesisDirectedbyOligonucleotide 利用一段人工合成的含有突变序列的寡核苷酸片段 取代野生型基因中的相应序列 从而达到定点突变的目的 称为盒式诱变 实施盒式诱变时 要求靶DNA插入点两侧有合适的限制酶单一切点 1 1CassetteMutagenesis ProcessofCassetteMutagenesis AnExampleofCassetteMutagenesis 1 2DopedCassetteMutagenesis 粘性盒式诱变通常同时设计并合成两套带突变碱基的寡核苷酸单链 然后在DNA聚合酶的催化下进行重叠延伸 用限制酶切断后 可获得两套双链的寡核苷酸片段 即可用于取代原有的目的基因片段 此法可提高基因诱变的效率 DopedCassetteMutagenesis 利用一段含有突变序列的寡核苷酸片段作为引物 经DNA复制过程合成靶DNA片段 使其子代链发生突变 称为引物诱变 1 3PrimerMutagenesis 引物诱变的基本操作步骤 获得单链目的基因 人工合成带突变序列的引物 制备异源双链DNA 转染宿主细胞 筛选重组体 突变基因的鉴定和回收 ProcessofPrimerMediatedMutagenesis 1 4QuikChangePrimerMutagenesis 这是由Stratagene公司开发的一种引物定点诱变法 该法的操作步骤如下 将带目的基因的重组体在dam 菌株中扩增 使DNA序列被dam甲基化酶所修饰 使用带突变碱基的寡核苷酸引物 在较高温度下复制子代链 形成双链突变体 用限制酶Dpn 将带甲基化标记的亲代双链水解 将突变体转化宿主细胞 ProcessofQuikChangePrimerMutagenesis 1 5TheKunkelMutagenesisMethod 这是1985年由Kunkel等人建立的一种寡核苷酸引物诱变法 该法的操作步骤如下 将复制型的M13噬菌体转染到脱氧尿苷三磷酸酶和尿嘧啶脱糖苷酶双缺陷的E coli dut ung 菌株中生长 使U取代T掺入到DNA链中 一般每个重组体20 30个 以此种带U的DNA链为模板 用带突变碱基的寡核苷酸引物进行复制 产生异源双链 将此异源双链转化到ung 尿嘧啶脱糖苷酶阳性 菌株中生长 含U的模板链被破坏 从而使子代DNA链大部分 80 含突变碱基序列 ProcessofTheKunkelMutagenesis 1 6PrimerMutagenesiswithRestrictionEnzymeSiteElimination 限制酶位点消除引物诱变技术是一种利用某些限制酶不能切割由硫代磷酸核苷酸衍生物取代正常碱基所形成的DNA片段的特性 去除不含突变碱基的亲代模板链 以提高定点突变效率的技术方法 限制酶位点消除法的操作步骤是 将带突变碱基的寡核苷酸引物与重组体单链模板退火后 加入硫代磷酸核苷酸衍生物进行复制 产生具有硫代磷酸核苷酸的异源双链DNA 用特定的限制酶在此异源双链DNA上作切口 此时亲代模板链由于无硫代磷酸核苷酸而被切开 而新合成的子代链则无法切割 使用核酸外切酶将亲代模板链全部水解去除 然后再以含硫代磷酸核苷酸的子代单链为模板 经二次复制合成双链 PrimerMutagenesiswithRE SiteElimination 2 Site directedMutagenesisbyPCR 将所使用的引物之一进行定点碱基突变后 作第一轮PCR扩增 将第一轮扩增产物作为第二轮PCR扩增的引物来使用 从而使第二轮扩增的产物带突变的碱基 2 1 1MegaprimerExtensionPCRMutagenesis 2 1BaseSubstitutionMutagenesis MegaprimerExtensionPCRMutagenesis 2 1 2OverlapExtensionPCRMutagenesis 使用带突变碱基的互补引物对两段目的基因序列分别进行第一轮PCR扩增 将扩增产物进行重叠退火延伸 获得带突变碱基的完整序列 使用该完整序列的两端引物进行第二轮PCR扩增 OverlapExtensionPCRMutagenesis 2 2DeletionPCRMutagenesis 用于PCR扩增的引物中存在人为的DNA片段的缺失 这样就会在PCR扩增后的产物中引入此缺失 此法适用于在扩增DNA序列的末端制造缺失序列的情况 2 2 1DeletionMutagenesisUsingMismatchPrimer DeletionMutagenesisUsingMismatchPrimer 2 2 2DeletionMutagenesisbyPCRFusion 使用两套引物分别扩增欲缺失片段两侧的序列 此两套引物的5 端序列互补 利用两套扩增产物5 端的互补序列进行退火重叠并进行第二轮PCR延伸 获得完整的突变体 DeletionMutagenesisbyPCRFusion 2 2 3DeletionMutagenesisbyInvertedPCR 将带目的基因的DNA重组体作为模板进行PCR扩增 所设计的一对引物与目的基因的两侧序列互补 不包括需缺失的序列 并向载体DNA方向进行扩增 扩增后的线性产物依靠两侧的互补序列重新退火并连接成环状的双链DNA DeletionMutagenesisbyInvertedPCR 2 3InsertionPCRMutagenesis 使用5 端带有与目的基因互补的一对引物来对欲插入的DNA片段进行PCR扩增 将扩增产物与单链的目的基因重组体进行退火 延伸并连接 生成异源双链的重组体 转化宿主细胞以获得带有新插入序列的双链重组体 2 3 1InsertionMutagenesisbyPCRRecombination InsertionMutagenesisbyPCRRecombination 3 3 2InsertionMutagenesisbyPCROverlapExtension 设计并合成两套用于PCR扩增的引物 分别用于目的基因两侧半序列的扩增 但在这两套引物的5 端均添加了欲插入的互补序列 经PCR扩增后的产物 通过此互补序列进行重叠延伸 生成完整的双链DNA 即可将新的序列引入目的基因中 InsertionMutagenesisbyPCROverlapExtension 2 4ErrorProne Sloppy PCRMutagenesis 错误倾向PCR诱变是通过增加Mg2 和TaqDNA聚合酶的浓度 使PCR扩增过程中复制错配率增加而随机产生碱基突变 4 ApplicationofSite directedMutagenesis 研究基因的结构与功能之间的关系 研究DNA 蛋白质 蛋白质 蛋白质的相互作用关系 蛋白质工程 Chapter13Tumor associatedGenes 肿瘤细胞是一种不受体内生长调控系统的控制而自主生长增殖 并可发生侵袭和转移的恶性细胞 目前已知 肿瘤的发生 发展与癌基因 on cogene 和抑癌基因 tumorsuppressorgene 的结构和功能改变密切相关 Section1OncogeneandProto oncogene 1 DiscoveryandConceptofOncogene 1911年ReytonRous将鸡肉瘤的无细胞滤液注射给鸡后 可诱导发生肉瘤 说明无细胞滤液中的感染颗粒是引起Rous鸡肉瘤的原因 这种感染性颗粒后来被证实是逆转录病毒 追踪研究逆转录病毒致癌的线索 Bishop等人于1980年提出了癌基因假说 根据这一假说 引起Rous鸡肉瘤等的逆转录病毒的基因组中存在有致癌基因 即病毒癌基因 v onc 存在于正常细胞中与病毒癌基因具有同源顺序的基因则被称为细胞癌基因 c onc c onc在正常细胞中一般以非激活形式存在 参与细胞的生长 分化与凋亡的调控 故又称为原癌基因 proto oncogene 因此 癌基因 oncogene 就是存在于正常细胞中 能够编码生长因子 生长因子受体 细胞内信息分子及转录因子的基因 即编码关键性调控蛋白的正常细胞基因 2 ClassificationandFunctionofOncogene 目前发现的癌基因已超过100种 主要根据癌基因表达产物的结构 功能和亚细胞定位进行分类 生长因子类 生长因子受体类 酪氨酸蛋白激酶类 丝氨酸 苏氨酸蛋白激酶类 GTP结合蛋白 G蛋白 类 核内转录因子类 2 1TheClassRelatedwithGrowthFactor PDGF relatedOncogenesv sis和c sis癌基因的编码产物p28sis 为分泌型蛋白质 由两条相同的多肽链组成 与PDGF的 链同源 在功能上与PDGF有相同的效应 EGF relatedOncogenesTGF A癌基因编码分泌型转化因子 TGF 与EGF属同一家族 其作用的受体为癌基因erbB编码的蛋白质 FGFFamily relatedOncogenes包括c int 2 c hst 1 FGF 5 FGF 6等癌基因 其编码产物与FGF同源 EGFR relatedOncogenes包括c erbB 1 c erbB 2 neu 等癌基因 其编码产物与EGF受体同源 但有结构上的改变 如丢失了受体N 端的配体结合结构域 使受体蛋白无需配体的刺激即具有持续的活性 2 2TheClassRelatedwithGrowthFactorReceptor NGFR relatedOncogenesc trk癌基因编码产物与NGF受体同源 其膜外区被其他基因的编码序列所替代后产生转化活性 CSFR relatedOncogenesc fms癌基因编码产物与集落刺激因子受体 CSF 1R 同源 MolecularStructureofGrowthFactorReceptorRelatedwithOncoproteins 此类癌基因的编码产物为具有酪氨酸蛋白激酶 TPK 活性的细胞生长信号转导蛋白 通常存在于胞浆或细胞核中 2 3TheClassRelatedwithTyrosineProteinKinase SrcFamilyOncogens包括c src c yes c fgr c fyn等癌基因 其编码产物具有TPK活性 一般借助于N 端的豆蔻酸而挂于细胞质膜上 可被生长因子受体或细胞因子受体激活 InhibitionofPhosphorylatedTyr527forsrcKinaseActivity v srcisMissingaC terminalRegulatoryDomain AblFamilyOncogenes包括c abl c fes等癌基因 也具有TPK活性 但游离存在于细胞核内 传递生长刺激信号 癌基因的编码产物具有Ser Thr蛋白激酶活性 并在生长信号传递过程中起作用 RafFamilyOncogenes包括c Raf 1 A Raf B Raf c mos等癌基因 在MAPK级联信号转导途径中起作用 2 4TheClassRelatedwithSer ThrProteinKinase PKCFamilyOncogenes编码12种不同的同工酶 可经磷酸化修饰而激活c Raf 1 从而传递生长刺激信号 此类癌基因主要是ras家族癌基因 包括H ras 1 2 K ras 1 2 N ras等 此类癌基因编码小分子G蛋白 具有GTPase活性 其活性受到鸟苷酸交换因子 GEF 的正调控和GTP酶激活蛋白 GAP 的负调控 2 5TheClassRelatedwithGTPBindingProtein 小分子G蛋白 如Ras激活后可将生长刺激信号传递给c Raf 1 如癌基因发生突变而使G蛋白的GTPase活性降低 则可导致该蛋白持续激活 此类癌基因的编码产物位于细胞核内 具有转录因子的结构与功能 参与细胞增殖的调控 2 6TheClassRelatedwithNuclearTranscriptionFactor MycFamilyOncogenes包括c myc N myc L myc等癌基因 其编码产物为转录因子 形成myc max异源二聚体时具有激活基因表达的功能 FosandJunOncogenes编码产物为转录激活因子 1 AP 1 的两个亚基 二者结合形成异二聚体后具有激活基因转录的功能 ErbAOncogene编码产物为甲状腺激素受体 当该受体结合激素结构域缺失后 受体即具有持续激活基因表达的作用 其他还包括myb ets rel evi spi等癌基因 3 MechanismsofProto oncogeneActivation 即原癌基因的结构发生改变 从而影响其功能或生理活性 常见的有点突变 缺失突变和插入突变等 3 1Proto oncogeneMutation 3 1 1PointMutation 点突变常见于ras癌基因 点突变主要发生在12 13 61或63位氨基酸残基处 发生点突变后的Ras蛋白与GTPase激活蛋白 GAP 的亲和力降低 从而使其GTPase活性降低而处于持续激活状态 Ras GTP 缺失突变的典型例子是c erbB 1原癌基因和c erbA原癌基因 c erbB 1原癌基因的编码产物与EGFR同源 其细胞外配体结合区发生缺失突变后 使受体处于持续激活状态 3 1 2DeletionMutation c erbA原癌基因的编码产物与甲状腺激素受体同源 其配体结合区发生缺失突变后 受体的转录活性和DNA结合活性失去控制 从而持续刺激基因表达 此外 在逆转录病毒所携带的病毒癌基因中 也可见到因原癌基因缺失突变而激活的例子 如v src病毒癌基因 是逆转录病毒在长期进化过程中 将宿主细胞中的c src原癌基因转导并整合到其基因组中 并使其C 端发生缺失突变而激活为病毒癌基因 其编码产物具有持续TPK活性 由于顺式作用元件 如启动子 增强子等插入到原癌基因上游或附近而导致其激活并异常表达 或由于其他基因片段的插入产生了新的融合基因 使其编码产物的生理功能发生异常改变而导致细胞转化 3 1 3InsertionMutation 逆转录病毒的强启动子或强增强子序列常常插入到某些原癌基因上游或附近 从而使该基因异常表达而被激活 常见的有c myc c sis c erbB c ras c myb等原癌基因 InsertionActivationofc mycProto oncogene 染色体的重排常常也会造成原癌基因易位到其他基因的强启动子下游或强增强子附近而被激活 在人类巴基特淋巴瘤的细胞系中 发现带c myc原癌基因的第8号染色体长臂远端片段易位至第2 22和14号染色体的一定部位 并位于免疫球蛋白轻链或重链基因强启动子的下游而被激活 除此之外 染色体重排也会使原癌基因易位并插入到其他基因中 形成新的融合基因 从而引起该原癌基因表达的融合蛋白产物的功能改变而被激活 在慢性粒细胞性白血病细胞中 常常可见到的Ph1染色体 就是由于9号染色体与22号染色体重排所致 重排后 c abl原癌基因与bcr基因融合而被激活 其编码的abl bcr融合蛋白具有持续的TPK活性 Ph1ChromosomeinCMLCells 3 2Proto oncogeneAmplification 基因扩增引起原癌基因拷贝数目增加 导致染色体结构异常 常形成双微染色体 DM 或染色体均染区 HSR 其机制不明 DMandHSR B homogeneousstainingregion HSR A doubleminutechromosome DM 基因扩增常常导致原癌基因表达增强而被激活 常见于myc家族原癌基因 3 3AlternationofProto oncogeneMethylation 在肿瘤细胞中可发现原癌基因的甲基化修饰改变 表现为原癌基因的低甲基化或去甲基化而被激活 如在胃癌细胞中发现了c Ha ras癌基因的低甲基化修饰 而低甲基化可导致c Ha ras癌基因的过度表达 Section2TumorSuppressorGene 1 DiscoveryandConceptofTumorSuppressorGene 20世纪70年代初 在研究体细胞杂交时发现 肿瘤细胞与正常细胞进行融合 结果产生正常的杂交细胞 这种现象表明 在正常细胞中含有抑制肿瘤生长 调节细胞正常生长的物质 1 1DiscoveryofTumorSuppressorGene 1985年 Cavence等从两个患遗传性视网膜母细胞瘤家族中 发现肿瘤细胞缺失了位于13q14区的Rb基因 且当Rb基因为纯合子时就会诱发肿瘤 从而首次发现并证实了抑癌基因 抑癌基因 tumorsuppressorgene 又称抗癌基因 anti oncogene 肿瘤易感基因或隐性癌基因 是一类存在于正常细胞中 其编码产物能抑制细胞生长增殖的基因 由于这类基因的缺失 突变或甲基化引起的失活 最终导致肿瘤的发生 1 2ConceptofTumorSuppressorGene 目前已被人们认识和克隆的抑癌基因有40多种 可分为两大类 抑制细胞增殖的抑癌基因 参与DNA损伤修复的抑癌基因 抑制细胞增殖的抑癌基因 Rb retinoblastomagene p53 P53gene p21Waf1 Cip1 wildtypep53 activatedfragment1 CDK interactingprotein1 p27Kip1 kinaseinhibitionprotein1 DCC deletedincolorectalcancer NF1 2 neurofibromatosisgene INK4 inhibitorofCDK4andCDK6 PTEN phosphataseandtensinhomolog nm23 non metastasis23 FHIT fragilehistidinetriad DPC4 deletedinpancreaticcancerlocus4 参与DNA损伤修复的抑癌基因 MSH2 E coliMutShomolog2 MLH1 E coliMutLhomolog1 PMS1 2 DNAmismatchrepairprotein1 2 GTBP G T bindingprotein BRCA1 2 breastcancersusceptibilitygene1 2 ATM ataxia telangiectasismutatedgene 抑癌基因的蛋白产物广泛分布于细胞核 细胞浆和细胞膜等亚细胞部位 其编码蛋白产物的功能主要有 编码或激活转录因子 参与细胞周期调控 参与DNA损伤修复 触发程序性细胞凋亡 参与细胞间的粘连 连接细胞与细胞骨架 维持细胞正常形态 GTP酶的激活因子 2 SomeTumorSuppressorGenesandTheirFunctions Rb基因是于1986年首次克隆的第一个抑癌基因 该基因存在于人染色体13q14区 由27个外显子构成 分布在总长180 200kb以上的DNA片段上 2 1RbGene Rb基因转录的mRNA大小为4 7kb 编码一个分子量为105kD的蛋白质 称为p105Rb 由928个氨基酸残基构成 定位于细胞核内 参与细胞周期调控 低磷酸化型的p105Rb可与转录因子E2F形成复合物 从而阻止E2F启动对某些细胞增殖相关基因的转录 高磷酸化型的p105Rb可促使其与E2F分离 使E2F呈现活性 Rb基因在遗传学上是隐性的 即必须两个等位基因同时缺失形成所谓的缺失纯合子 或一个等位基因缺失而另一基因突变而失活 才能导致基因功能的丧失 从而诱发肿瘤 p53基因定位于人染色体17p13 1区 全长约20kb 由11个外显子组成 人p53基因的转录受两个启动子控制 P1位于第1外显子上游 P2则位于第1内含子5 端 但通常由P1启动子来控制转录 该基因转录的mRNA为2 2 2 5kb 2 2p53Gene 2 2 1Structureofp53Gene P53蛋白产物分子量为53kD 由393个氨基酸残基组成 可分为三个结构域 N 端酸性区 由第20 42位的肽段 二级结构多为 螺旋 此区具有转录激活作用 2 2 2StructureandFunctionsofP53Protein 中段疏水区 包括100 292位的肽段 二级结构多为 折叠 该区主要与DNA特异序列结合有关 需结合Zn2 C 端碱性区 包括319 393位的肽段 该区与P53的四聚化及活性调节有关 MolecularStructureofP53Protein P53ProteinBindingwithDNA 一些病毒蛋白可与P53结合 使其转录活性受到抑制或更易经泛素途径降解 其中主要有 人乙型肝炎病毒HBX蛋白 人乳头状瘤病毒E6蛋白 SV40大T抗原 腺病毒E1B蛋白等 2 2 3InteractionofP53ProteinwithVirusProteins P53蛋白的生物学功能较为复杂 已知的功能有 抑制细胞增殖 P53蛋白可作为转录因子 促进WAF1 CIP1基因表达而生成P21WAF1 CIP1蛋白 抑制CDK2的活性 从而阻碍细胞进入S期 从而诱导细胞生长停滞于G1期 2 2 4BiologicalFunctionsofP53Protein 促进DNA损伤的修复 P53蛋白可促进GADD45基因 growtharrestandDNAdamageinduciblegene 表达生成GADD45蛋白 后者与CDK及PCNA形成的复合物 参与DNA损伤的修复 诱导细胞凋亡 当DNA损伤不能修复时 P53蛋白诱导bax基因表达 并抑制bcl 2基因表达 使bax bax同源二聚体生成增加 从而诱导细胞凋亡 诱导细胞分化 P53蛋白可诱导前B细胞株L12的分化 p53抑癌基因常因发生突变而失活 迄今已在许多恶性肿瘤细胞 如结肠癌 肺癌 膀胱癌 乳腺癌 肝癌 食道癌等细胞中发现p53基因的突变 而且频率非常高 基因突变的类型以杂合缺失 LOH 和点突变较常见 且大多数的点突变都是错义突变 2 2 5Mutationofp53GeneinTumorCells 该基因家族包括INK4A MTS1 multipletumorsuppressor INK4B MTS2 INK4C INK4D等抑癌基因 这些