分子生物论文.doc

分子生物学作业学 号：0914120130姓 名：刘 义 2009级中药本一班 山药中胆碱对流涎或唾液分泌过量治疗作用的研究一、 研究背景：唾液是主要由三对大的唾液腺(下颔腺、腮腺和舌下腺)分泌入口腔，且下颔腺、腮腺和舌下腺分别提供其中的70%、25%和5%的量。涎腺是产生和分泌唾液的主要部位，由副交感神经及交感神经调节，但是主要是副交感神经起作用，主要对下颔腺调节。因此中枢和大脑皮质中枢的兴奋，引起唾液大量分泌。流涎在婴儿中是正常的,但有相当比例的发育缺陷患者主要由神经肌肉功能障碍引起的流涎,由此影响吞咽。唾液中含有凝血因子、血浆白蛋白、葡萄糖、氨基酸、枸橼酸、乳酸、尿素、尿酸、肌酸苷、脂肪酸、皮质类固醇和免疫球蛋白IgG、IgG、IgM等。腺细胞分泌或排出唾液是消耗营养物质和耗氧的主动活动过程。 口角流涎症是26岁小儿常见病。此病往往沾污衣服、枕被,很不卫生,好发于冬春季节,若日久不治,可使口角及下唇颌浸淫成疮。 正常情况下唾液一天的分泌量为10001500ml，流涎即是唾液的分泌超过正常水平，唾液流速受神经控制，如使用氯氮平等产生的流涎副作用药品服用导致流涎或唾液分泌增多，有部分孕妇唾液也会不知不觉分泌增多。随着生活速度加快，人的社会压力增大以及人们不正常的生活习惯，以及抑郁症导致唾液分泌过多的患者日益增多。流涎症已经成为困扰人们正常生活的疾病。目前在国内治疗流涎的药品主要为胆碱受体阻断药，如阿托品，用量不同药效也会不同，必须在医生的监督指导下使用，不方便。胆碱受体阻断阻断药产生的副作用大，如对膀胱有强烈的刺激作用，不易于小孩等使用。第二种为芷闲胶囊，这是中药的合成剂，而且价格昂贵，且副作用以及作用机理不明确。第三种为格隆溴铵，为2010年7月,美国FDA批准了盐野义制药公司开发的格隆溴铵口服液，用于治疗316岁儿童和青少年因大脑性麻痹等神经病学疾病引起的慢性严重流涎。格隆溴铵为乙酰胆碱受体的竞争性抑制剂，其作用比阿托品好但是副作用与阿托品相似，用药的范围小，且在国内的价格也相当贵。第四，中医理论下地针灸等中医治疗方法，不方便且不易于推广。因此研究治疗流涎或唾液分泌增多使用简便且便宜的新型的药物是相当必要和紧迫。在中医理论上山药有健脾、除湿、补气、益肺、固肾、益精的功效，山药含有可溶性纤维，能推迟胃内食物的排空，控制饭后血糖升高。 能助消化、降血糖。山药中含有大量的胆碱类的化学成分。根据山药中胆碱为生物碱类，且具有与阿托品相似得结构。本文提出山药中的胆碱可以治疗流涎或唾液分泌过量。唾液分泌的调节完全是神经反射性的，包括非条件反射和条件反射。副交感神经兴奋时，其末梢释放乙酰胆碱作用于唾液腺使之分泌大量稀薄的、酶多消化力强的唾液。如用乙酰胆碱或类似药时，可引起大量唾液分泌，而用抗乙酰胆碱药（如阿托品），则能抑制唾液分泌。腮腺、颌下腺等外分泌腺含有M2和M3两种受体,以M2为主，腺体主要由胆碱受体体与乙酰胆碱结合后增加唾液的分泌毒蕈硷乙酰胆碱受体(mAChR)是膜受体家族的成员,通过与异三聚体鸟苷酸结合蛋白(G蛋白)偶联介导信号转导过程。二、预用的实验技术及资料 本文拟通过制作变应性流涎动物模型,观察山药胆碱对腺体的的影响检测流涎动物模型的唾液与其他各组以及又要前后的量的变化;并运用克隆技术，对M2和M3的mAChR进行研究（检测毒蕈硷乙酰胆碱受体表达和功能的调节及其介导新的信号途径），注入药品后，M2和M3的对动物的唾液分泌的作用机理，同时与对照组进行对比。运用HPLC-荧光检测法测定大鼠血浆及脑组织中神经递质（乙酰胆碱）的含量，与阿托品组以及正常组进行对比。运用EFG（此技术目前用于临床，检测六种脑神经递质的量的变化，从而判断病情，目前在中国此技术很少使用，本文假设实验资金充足情况下，将EFG改装能满足本实验的检测）监测乙酰胆碱的量，判断是否是山药胆碱的药物对神经的作用，并与阿托品组进行对比。 三种方法确定山药胆碱的作用及位置。再用受体与山药胆碱结合，蛋白质技术测量G 蛋白功能是否受其影响；做体外实验，用荧光标记法判断是否是山药胆碱与乙酰胆碱受体结合，发挥了药效作用。 三、实验步骤与预期结果： 1.提取并获得山药中的胆碱成分或通过购买（为了实验精确以及有精密设备最好是自己提取）； 2.取8只大白鼠，雌雄各半，随机分配成三组，每组为一雌一雄。标记为A1,2组；B1,2组；C1,2组；E1,2组。并测量每只老鼠每分钟的分泌量。对各组老鼠分别滴入毛果芸香碱溶液的口腔内，0.02mg-0.04mgkg，造成唾液分泌增多模型，然后A1,2给入山药胆碱，B1,2组注入阿托品,C1,2组滴入相同比例的生理盐水，E组作为正常组。初步测量其唾液的每分钟的分泌量量。预期A和B组的唾液比C,E组少。 3.用克隆技术分别对每组的大鼠的M2和M3的mAChR作用机理分析，从而检测乙酰胆碱受体表达和功能的调节及其介导新的信号途径。对比两种受体在各组中的作用变化。 4.运用HPLC-荧光检测法测定阿托品组与山药胆碱药物模型组大鼠血浆及脑组织中内乙酰胆碱的的含量。 5.用膜片钳对测定给药模型组可能由于乙酰胆碱的量增加，导致的增加，细胞内外电流的变化，并与正常组以及阿托品的电流变化相比。由于神经末梢乙酰胆碱增多导致，细胞内外的电流变化，预测A,B电流变化明显，C,E组几乎无变化6.用EFG技术对过模型组对脑神经内分泌的乙酰胆碱，进行检测，作图并对比每组的变化。A,B组的乙酰胆碱明显多于C,E组。四、结论： 山药胆碱能治疗流涎症或唾液分泌过量，有抑制唾液分泌的作用。五、文献：01 Hirshman CA,Lande B,Croxton TL.Role of M2 muscarinic receptors inairway smooth muscle contractionJ.Life Sci,1999,64(6/7):443-448.02HuiZhen Wang,HongHan,Liming Zhang,et al.Expression of multiplesubtypes of muscarinic receptors and cellular distribution in the humanheartJ. Life Sci, 2001,59(5):1029-1036.03Hong S,HuiZheng W,Zhiguo W.Identification and characterization ofmultiple subtypes of muscarinic acetylcholine receptors and their physio-logical functions in canine heartsJ.Molecular Pharmacol,1999,55:497-450.04Lauries N,Rosoff M,Susan EH,et al.Molecular analysis of the regula-tion of muscarinic receptor expression and functionJ.Life Sci,1999,64(6/7):375-379.05El-BdoouiH,Jonathan R.Regulation ofthe expression and function ofthemuscarinic receptorJ.TIPS,1998,19:322-327.06Lise AS,Stephen JH.Gprotein-coupled-receptor cross-talk: the fine-tun-ing of multiple receptor-signalling pathwaysJ.TIPS,1998,19:87-93.07Bunemann M,Hosey M.Novel signaling events mediated by muscarinicreceptor subtypesJ.Life Sci,2001,68:2525-2533.08 荧光检测法测定大鼠血浆及脑组织中种单胺类神经递质，09 毒蕈碱样乙酰胆碱受体及其拮抗剂在近视发生发展中的作用10 抽薪散治疗小儿口角流涎症，（任宏宽 林鸿淼 ）11 /refbook/basicse