2012年卫生专业技术高级职称评审临床论文 (5).doc

晋升网官方域名：干扰素对肾小球肾炎大鼠肾组织Smad7和型胶原mRNA表达的影响 作者：姜琳1， 孙灿林1， 肖蔚2， 蒋小芹2， 李慧3， 于鸿2 作者单位：(1.泰州市人民医院麻醉科， 江苏 泰州 225300; 2.泰州市人民医院病理科， 江苏 泰州 225300; 3.复旦大学上海医学院病理系， 上海 200032) 【摘要】目的：研究IFN-对Thy1肾炎模型大鼠肾组织Smad7及型胶原表达的影响，从而为阐明IFN-抗肾纤维化机制及治疗肾纤维化提供理论和实验依据。方法：制备大鼠抗胸腺细胞血清(antithymocyte serum，ATS)肾炎模型，经尾静脉一次注射IFN- 15万IU/kg，采用Northern blot及免疫组化检测病变肾组织Smad7、型胶原的表达水平。结果：注射IFN-的ATS肾炎模型大鼠肾组织内Smad7的表达增加，型胶原mRNA的表达明显减少。结论：IFN-可能是通过上调Smad7表达而抑制肾组织型胶原表达的机制，对肾小球纤维化起抑制作用。 【关键词】 系膜细胞;干扰素;Smad7;型胶原;信号转导;肾小球肾炎 AbstractObjective： To investigate the mechanism of IFN- antifibrosis and provide value clues for searching and developing new approaches to the prevention and treatment of organfibrosis ，the expression of Smad7 and type collagen was detected in renal tissue of rat ATS glomerulonephritis. Methods： Rat antithymocyte serum glomerulonephritis model was built successfully adopting injection of IFN- 15104 IU/kg vie tail vein once time. Northern blot and immunohistochemistry were employed to identify protein and mRNA expression of Smad7 and type collagen (Col ) in renal tissue of rat ATS glomerulonephritis， respectively. Results： IFN- could increase the expression of Smad7 and decrease the expression of Col in renal tissue of rat ATS glomerulonephritis. Conclusion： It is possible that IFN- can alleviate the development of glomeruli fibrosis by the mechanism of upregulating the expression of Smad7， then downregulating the expression of Col . Key wordsmesangial cell;interferon-; Smad7; type collagen; signal transduction; glomerulonephritis 人类各种肾小球疾病病变进展的共同结局是肾小球硬化，其重要的病理特征是肾小球内细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的积聚。ECM是细胞的支架组织，在细胞黏附、迁移、增殖和分化过程中均起着重要的作用，其合成和降解失衡是导致肾小球硬化的重要发生机制1。近年来通过上调Smad7阻断TGF-信号转导通路以达到拮抗肾间质纤维化的实验性治疗研究已成为肾病研究领域的一个热点。动物实验显示，将含有腺病毒载体的重组小鼠Smad7 cDNA导入由博来霉素所诱导的肺纤维化小鼠模型体内后，肺组织内型胶原mRNA、羟脯氨酸含量降低且组织病变程度减轻，并推断其作用机制可能与Smad7阻断细胞内Smad2的磷酸化过程有关2。Lan等3构建超声微泡介导靶向治疗系统，通过上调Smad7基因表达来治疗大鼠梗阻性肾纤维化模型获得成功。自1954年作为抗病毒物质的干扰素(IFN-)问世以来，其抗病毒、免疫调节和抗肿瘤等作用已得到广泛承认。越来越多的研究结果表明，IFN-尚具有较好的抗纤维化功能，表现为抑制多种细胞的增殖及其ECM的合成。IFN-的信号转导是通过与跨膜受体结合，并激活与受体连接的酪氨酸激酶JAK，再磷酸化激活细胞质内转录因子STAT，STAT形成二聚体，转移至核内结合到IFN-激活反应基因序列上，从而促进反应基因的转录表达4。研究显示，Jak-STAT通路与Smad信号通路存在交叉，IFN-可促进Smad7的表达，进而抑制器官纤维化5。本实验构建大鼠抗胸腺细胞血清(antithymocyte serum， ATS)肾小球肾炎动物模型，经尾静脉一次注射IFN-，观察IFN-对大鼠Thy-1肾炎模型病变肾组织Smad7及型胶原表达的影响。 1材料与方法 1.1主要实验材料及试剂 SD大鼠，雄性，150 g左右(购至复旦大学医学院实验动物部);鼠抗Thy1多克隆抗体、鼠抗型胶原(type collagen， Col )单抗及鼠抗Smad7单抗购自Oncogene公司。注射用人重组IFN-购自上海克隆生物高科技有限公司(100万IU/支)，Trizol试剂盒购自Gibcobrl公司，Smad7、Col 标记试剂盒及内参照GAPDH探针购自Roche公司。 1.2大鼠抗Thy1肾小球肾炎(ATS)动物模型制作 参照Xu等6方法制备大鼠抗Thy1肾小球肾炎动物模型。雄性SD大鼠150 g左右，尾静脉注射ATS抗体，剂量为0.5 mg/100 g(0.8 ml/只)，注射一次。 1.3实验分组 24只大鼠随机分为3组： IFN-组，10只;ATS肾炎组(模型组),10只;正常对照组，4只。其中IFN-组、ATS肾炎组均经尾静脉一次注射ATS抗体(0.5 mg/100g)，IFN-组同时经尾静脉一次注射IFN- 15万IU/kg，对照组经尾静脉一次注射等量生理盐水。 1.4肾小球Smad7与Col 免疫组化染色 肾组织石蜡切片50 烘烤过夜。切片脱蜡入水，1.8%H2O2/甲醇去内源性过氧化物酶，微波变性10 min,30 ，正常血清封120 min，一抗37 60 min后过夜，生物素化二抗及ABC复合物，DAB显色，树胶封片。分别用正常血清及TBS替代一抗作阴性对照。 1.5Northern blot检测肾组织Smad7、Col mRNA 肾皮质总RNA的提取按Trizol试剂盒说明书进行。称取0.1 g肾皮质组织，放入加有液氮的研钵中快速研磨，然后再放入匀浆器中，加入1.5 ml Trizol充分研碎，移入2 ml Eppendorf管中，室温放置5 min。提取肾皮质总RNA，定量。Smad7、Col 探针采用PCR法-DIG标记法，按试剂盒说明书步骤进行标记，65 预杂交3 h，杂交1624 h，加入抗Dig抗体(1 5 000)37，60 min，CSPD化学发光法显影，暗室内压X光片1030 min，显影、定影后观察。所有实验重复3次。 1.6定量和统计分析 Kodak Digital Science 1D测定条带的积分光密度(ID)，其中ID值等于平均光密度与条带面积之乘积，所有数据以均数标准差(xs)表示，用SPSS13.0软件包对数据进行标准差计算和t检验。 2结果 肾小球Smad7免疫组化染色结果显示，与正常对照组比较，ATS肾炎组Smad7表达显著减少;与ATS肾炎组比较，IFN-组Smad7表达显著增加(图1)。 肾小球Col 免疫组化染色结果显示，与正常对照组比较，ATS肾炎组Col 表达明显增加;与ATS肾炎组比较，IFN-组Col 表达显著减少(图2)。 Northern blot结果显示，与正常对照组比较，ATS肾炎组(3 d,5 d)Col mRNA表达均明显增加(P0.01);与ATS肾炎组(3 d,5 d)比较，IFN-组(3 d,5 d) Col mRNA表达均明显减少(P0.05);IFN-组(3 d)与IFN-组(5 d)比较，Col mRNA表达差异无统计学意义(P0.05)。见图3。与正常对照组、ATS肾炎组比较，IFN-组Smad7 mRNA明显增加(P0.01，图4)。1：正常对照组;2：ATS肾炎组(3 d);3：ATS肾炎组(5 d);4：IFN-组(3 d);5：IFN-组(5 d)a：P0.01，与正常对照组比较;b：P0.01，与ATS肾炎组(3 d,5 d)比较图3Northern blot检测各组大鼠肾组织Col mRNA的表达1：正常对照组;2：ATS肾炎组(3 d);3：ATS肾炎组(5 d);4：IFN-组(3 d);5：IFN-组(5 d)图4Northern blot检测各组大鼠肾组织Smad7 mRNA的表达 3讨论 IFN-是由T、NK淋巴细胞分泌的多功能细胞因子，在先天与获得性免疫过程中发挥着重要的作用，IFN-抗病毒、免疫调节和抗肿瘤等作用已得到广泛的应用7。大量研究表明，IFN-尚具有较好的抗纤维化功能，表现为可抑制多种细胞的增殖及ECM的合成。细胞培养实验表明，IFN-可抑制体外培养的肝星状细胞的激活与转化并减少其ECM的合成;体内实验证实，IFN-可显著减少肝纤维化动物模型ECM的生成，显示较好的抗肝纤维化作用8。Foster等9报道，IFN-不仅可显著抑制小鼠骨骼肌撕裂伤模型纤维化进程，而且可以促进其损伤愈合。Oldroyd等10报道，IFN-显著抑制肾纤维化动物模型胶原的合成，其机制可能为IFN-与其膜受体结合后，直接影响靶细胞胶原基因的转录及转录后过程。临床上将IFN-应用于治疗原发性肺纤维化及多种原因所致的肝纤维化，尽管其机制尚有待深入研究，但已经取得较为肯定的疗效11。 大量研究证实，人类多种肾小球疾病，如系膜增生型肾小球肾炎、IgA肾病、新月体型肾小球肾炎等，TGF-表达增加，可促进肾小球系膜区ECM的合成，尤其是、型胶原与纤维连结蛋白合成增加;而过表达Smad7可显著抑制TGF-激活的Smad2，从而阻断型胶原的合成12。Chen等13通过转Smad7基因实施对肾纤维化动物模型作基因治疗的尝试，发现Smad7可抑制肾脏纤维化。对大鼠一次性注射Thy-1抗体，因系膜细胞表面有Thy-1样抗原，在注射后第1天可引起部分系膜细胞发生补体依赖性细胞溶解，随之受损伤的系膜细胞启动修复过程，系膜细胞大量增殖及肾小球内ECM广泛积聚，35 d病变发展至顶峰，形成急性系膜增生型肾小球肾炎动物模型，随后逐渐自愈14。然而目前有关IFN-对ATS肾炎影响的报道国内外均甚少见。本实验中，与正常对照组比较，免疫组化及Northern blot结果显示，ATS肾炎组Col 表达明显增加，而Smad7表达显著减少。ATS肾炎模型鼠在予以IFN-后，各时间点肾小球内Col 的表达均显著减少，而Smad7的表达显著增加，显示了IFN-对于ATS肾炎具有较好的抗纤维化作用，并且我们认为IFN-促进Smad7表达增加可能是其拮抗纤维化的重要机制之一。但由于IFN-是一种非常多效的细胞因子，其功能也很复杂，对免疫系统有着多种作用，包括促巨噬细胞细胞毒作用，促进Th1细胞生长、抑制Th2细胞生长，提高CD8+ T细胞和NK细胞细胞毒作用，上调MHC分子表达，及促进B细胞IgG2a表达等作用15。同时肾炎的各种类型及发病机制非常复杂，而对于IFN-抗纤维化机制并不十分明了，因此目前对于IFN-用于治疗肾炎后的纤维化/硬化，临床上尚有一定的争议。另外，考虑到我们的动物数量有限，受观察时间及所用剂量等因素影响，要得到明确结论仍有待进一步的实验研究。(本文图1，图2见封三)（晋升网（）是目前国内收录中文最多最权威医学杂志、医学杂志；网罗和甄选海量优秀医学论文，提供免费全文阅读。网站可以实现文章内容的全文检索，可以提供医学论文的免费查询、阅读、下载以及提供最及时的医学信息，最丰富的医学文献 ，最权威的期刊杂志，最有效的学习方法）。 【参考文献】 1 Pozzi A， Voziyan PA， Hudson BG， et al. 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