基因工程工具酶培训课件.ppt

第二章基因工程工具酶 分类 限制性内切酶 RestrictionEndonuclease RNaseA1 水解酶类核酸酶RNaseT1RNaseHDNase S1核酸外切酶 Exonuclease 大肠杆菌DNA聚合酶 DNAPol 大肠杆菌DNA聚合酶 大片段 KlenowFragment 2 DNA聚合酶类嗜热DNA聚合酶 Taq酶 DNA连接酶 Ligase 反转录酶 ReverseTranscriptase 小牛肠碱性磷酸酶 CIP 3 修饰酶类细菌碱性磷酸酶 BAP T4噬菌体多核苷酸激酶 T4PhagePolynucleotideKinase 鼠源禽源 一 限制性核酸内切酶的发现 二 限制性核酸内切酶的分类 三 限制性核酸内切酶的命名 四 II型限制性核酸内切酶的基本特性 五 限制性核酸内切酶的消化反应条件 一 限制性核酸内切酶 由寄主控制的限制和修饰现象 20世纪60年代 Linn和Arber发现 K 大肠杆菌B 大肠杆菌K EOP 1 EOP 1 EOP 10 4 EOP 10 4 EOP成斑率efficiencyofplating 外源DNA 自身DNA 一 核酸限制性核酸内切酶的发现 限制和修饰现象 限制 修饰的酶学系统 酶切位点不被修饰 噬菌体DNA被切割 酶切位点被修饰 基因组DNA不被切割 E coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶当 k 噬菌体侵染E coliB时 由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列 被降解掉 而E coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列 但可在EcoB甲基化酶的作用下 催化S 腺苷甲硫氨酸 SAM 将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基 使之甲基化 EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列 1962年瑞士的W Arber 阿尔伯 提出细菌的限制修饰系统 1968年发现 型内切酶 1968年美国的H O Smith发现 型内切酶 1970年美国的O Nathans 内申斯 用 型酶制备了肿瘤基因 1978年三人共获诺贝尔生理与医学奖 从此 相关研究展开 目前已纯化出3000种限制性内切酶中 其中有30 是在NEB发现的 概念 限制性核酸内切酶 restrictionendonuclease 一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列 并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶 切开的是3 5 磷酸二酯键 二 限制性核酸内切酶的类型及其主要特性 特性1 限制修饰活性2 内切酶的蛋白质结构3 限制辅助因子4 切割位点5 特异性切割6 基因克隆中 I型双功能的酶3种不同亚基ATP Mg2 和S 腺苷甲硫氨酸距特异性位点5 端至少1000bp不是 随机 无用 II型限制酶和修饰酶分开单一成分Mg2 位于识别位点上是非常有用 III型双功能酶2种亚基ATP Mg2 和S 腺苷甲硫氨酸特异性位点3 端24 26bp处是用处不大 三 限制性核酸内切酶的命名 1 寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个斜体字母的略语表示酶来源的菌种名称 如大肠杆菌Escherichiacoli表示为Eco 流感嗜血菌Haemophilusinfluenzae表示为Hin 2 用一个正体字母表示菌株的类型 比如EcoR Hind 3 如果一种特殊的寄主菌株具有几个不同的限制修饰体系 则用罗马数字标出 比如EcoRI HindIII EcoR 酶名称 EscherichiaColiRnis 属名种名株系编号 四 II型限制性核酸内切酶的基本特点 1 识别位点的特异性每种酶都有其特定的DNA识别位点 通常是由4 8个核苷酸组成的特定序列 靶序列 2 识别序列的对称性靶序列通常具有双重旋转对称的结构 即双链的核苷酸顺序呈回文结构 3 切割位点的规范性交错切或对称切 可形成粘性末端或平末端的DNA分子 能识别外源DNA并将其水解的内切核酸酶 是细菌对外源DNA的防御机制 几种II型限制性核酸内切酶的酶切位点 与II型核酸内切酶有关的几个概念 粘性末端cohesiveends是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构 它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来 平末端Bluntend在识别序列对称处同时切开DNA分子两条链 产生的平齐末端结构 则不易于重新环化 同裂酶isoschizomers能识别和切割同样的核苷酸靶序列的不同来源的内切酶 不同同裂酶对位点的甲基化敏感性有差别 同尾酶isocaudamers识别的靶序列不同 但能产生相同粘性末端的一类限制性核酸内切酶 如BamHI BclI BglII和XhoI是一组同尾酶 平齐末端 带5 P端的黏性末端 带3 OH和5 P端的平末端 例如Hpa 和Msp 是同裂酶 识别顺序都是5 C CGG 3 3 GGC C 5 如果其中有5 甲基胞嘧啶 Hpa 不能够切割 MspI能切割 同裂酶切割DNA时 产生相同的粘末端 故被切割得DNA可重组并且重组后产生两种情况A B 如图 MobIBamHIBglII5 NGATCN 3 5 N GGATCC N3 5 N AGATCT N3 3 NCTAGN 5 3 N CCTAGG N5 3 N TCAAGA N5 5 NGATCC N3 5 N GGATCT N3 3 NCTAGG N5 3 N CCTAGA N5 5 N GATCC N3 5 NGCATCT N 3 CTAGG N5 CGTAGA N 5 A 可被MobI识别切割 但不被B 重组DNA 不能被上述酶识别BamHI识别切割 与切割 注意 限制性内切酶对外源DNA的作用无种属特一性 对不同的外援DNA 只要有酶的识别顺序即可切割DNA产生相同的粘末端或平截末端 据此可进行DNA的重组 在A情况下产生的重组体只能被一种酶消化 减少了可逆反应 提高了重组率 转化后还可以用可消化的那种酶 Mob 进行酶切鉴定 在B情况下 产生重组体 不能再被两种酶识别 消除了可逆反应 效率更高 但转化后不能再用这两种酶鉴定 通常选A的情况 4 不具有甲基化功能II型限制性核酸内切酶的甲基化修饰作用由相应的甲基化酶承担 5 对单链DNA的切割切割效率较低 酶活单位一个限制酶单位 U 指 在理想的反应条件 适宜的缓冲液和反应温度 通常为37 下 1h内中完全降解1 g DNA所需要的酶量 五 限制性核酸内切酶的消化反应 酶切反应的基本步骤 电泳 紫外分析 37 1h 加反应液 CK M Buffer 10 2 0 LddH2O约16 5 LDNA0 2 1 0 gEnzyme1 2UVolume20 0 L 1 0kb 1 0kb 0 4kb 0 5kb 0 6kb CK M T T 反应体系 混匀 最适温度 酶量 时间 反应终止 电泳鉴定结果 在 非最适的 反应条件下 有些核酸内切限制酶识别序列的特异性便会发生 松动 从其 正确 识别序列以外的其它位点切割DNA分子 这种现象叫星号活性 用 表示 限制性内切酶的第二活力 Secondaryactivity 又称星号活力 指改变了酶的反应条件 使酶原有的识别特异性的降低 例如 EcoRI的典型特异性是核苷酸序列GAATTC 当改变此酶的反应条件时 他的特异性由原来的6核苷酸降低为四核苷酸AATT 星号活力的产生可为酶提供新的序列特异性 这些活性在某些情况下可能是有用的 但是很少导致第二识别位点的完全或同等的切割 因此为了避免星活力的出现 所有限制性酶切反应均应在标准条件下 通常反应条件通过缓冲液控制 六 影响限制性核酸内切酶活性的因素 影响酶活性的因素很多 最重要的有 酶纯度 DNA的纯度 DNA的甲基化程度 酶切反应的温度与时间 DNA的分子结构 限制性核酸内切酶的缓冲液 1 酶纯度引起某些酶活力变化的因素较多 包括甘油的浓度 离子的浓度 PH值 有机溶剂的存在 二价阳离子过高的酶和DNA浓度的比例 2 DNA纯度铂 酚 氯仿 酒精 EDTA SDS 盐离子等均影响酶活性 纯度不高 含有蛋白 特别是DNase加入Buffer时因有Mg2 而激活降解DNA样品 而无特异带 解决办法 扩大反应体积20 L 50 L延长酶作用时间1h 数小时增加酶用量1u 10u 3 DNA甲基化程度甲基化程度高不被大多数限制性内切酶切割 解决办法是 选用无甲基化酶的突变菌株 使用对甲基化酶碱基无切割能力的酶 对哺乳动物DNA 4 酶切反应的温度与时间所有限制性内切酶均应在标准条件下进行 大多数最适反应温度是37 少数耐热Taq 是65 Sma 是25 30 反应时间与酶量有关 5 DNA分子的构型不同构型的影响很大 消化超螺旋环状DNA用的酶量大于线性DNA不同位点切割能力不同 6 限制性核酸内切酶的反应缓冲液Mg2 Tris HCl NaCl或KCl 巯基乙醇或二硫苏糖醇 DTT 防止酶氧化 以保持活性 BSA 牛血清白蛋白 稳定酶蛋白 七 其它水解核酸的酶1 水解RNA的核酸酶 Rnase 种类很多介绍五种酶名称来源最适PH作用特点反应式应用RNaseA胰脏7 9切嘧啶产生ApUpCpNpRNA测序3 p嘧啶核苷酸或以其结ApUp Cp Np尾的寡核苷酸RNaseT1米曲霉4 5切G产生3 GpGpGpApCpGp同上或以其为结尾的寡核苷酸Gp Gp ApCpGpRNaseU2黑曲霉4 5切A产生3 APGpApCpApAp同上或以其结尾的寡核苷酸片段GpAp CpAp ApRNasephy头绒孢菌不切C产生3 Ap GpApCpUpGp同上3 Gp 3 Up或以其为结尾片段GpApCpUpGp RNaseH大肠杆菌水解DNA RNA杂交分子中的RNA 2核酸酶S来自稻谷曲霉高度特异性于单链核酸的内切酶 可催化单链RNA或DNA 降解成5 单核苷酸 同时也可作用于双链核酸分子的单链区 小到一个碱基 作用 测定杂交分子 DNA DNA 或 RNA DNA 的杂交程度 即使是一对碱基没杂交也能检测到 cDNA合成时去掉第一连与第二连的发夹结构测定DNA上内含子的位置 一 DNA连接酶的概念与作用机制 二 连接酶种类及特性的比较 三 DNA连接酶作用的特点 四 DNA连接酶的反应条件 五 影响连接反应的因素DNA连接的策略 六 T4DNA连接酶对目的DNA片段和载体连接的一般方案 二 DNA连接酶及其应用 DNA重组的核心技术 DNA片段之间的体外连接 连接酶 一 DNA连接酶的概念与作用机制 环形DNA分子的发现使科学家相信一定有一种能连接这种切口的酶存在 首个DNA连接酶 ligase 1967年 大肠杆菌DNA连接酶 是大肠杆菌基因编码 1970年 发现了T4DNA连接酶 由大肠杆菌T4噬菌体基因编码的 概念 DNA连接酶 Ligase 能够催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶 DNA连接酶的催化反应DNAligase NAD ATP 酶 AMP复合物 DNAAMP DNA 相邻3 OH对活化的磷原子发生亲核攻击 AMP3 5 磷酸二酯键 DNA连接酶连接的作用机制 二 连接酶种类及特性的比较 最常用 三 DNA连接酶作用的特点 A 连接的两条链必须分别具有自由3 OH和5 P 而且这两个基团彼此相邻 B 在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过程 E coliDNA连接酶 连接具互补碱基黏性末端 最初研究表明 现在研究可连接平末端 需NAD 辅助因子 活性低 不常用 T4DNA连接酶 连接具互补碱基黏性末端和平末端 需ATP辅助因子 活性高 常用 是双链 因此不能将两条单链连接起来或使单链环化起来 OHP 是相邻的 因此不能封闭gap 只能封闭nick gapNO NickOK 四 T4DNA连接酶连接反应的条件 连接酶反应体系 连接液灭活后最好立即转化或储存于4 8 时间不要太长 会降低转化率 DNA末端的浓度较高浓度的DNA 利于分子间连接 形成线性二聚体或多聚体分子 温度 通常在4 16 ATP的浓度 10 mol L 1mol L 连接酶浓度 一般平末端大约需1 2U 粘末端仅需0 1U 反应时间 通常连接过夜 插入片段和载体片段的摩尔比 1 1 5 1 五 影响连接反应的因素 六 T4DNA连接酶对目的DNA片段和载体连接的一般方案 1 连接反应一般在灭菌的0 2 0 5ml离心管中进行 2 10 l体积反应体系中 取载体50 100ng 加入一定比例的外源DNA分子 一般线性载体DNA分子与外源DNA分子摩尔数为1 1 5 1 补足ddH2O至8 l 3 轻轻混匀 稍加离心 56 水浴5min后 迅速转入冰浴 4 加入含ATP的10 Buffer1 l T4DNA连接酶合适单位 用ddH2O补至10 l 稍加离心 在适当温度 一般14 16 连接8 14hr 粘性末端DNA片段的连接 DNA连接酶连接法 Nick Nick 平末端DNA片段的连接 末端同聚物加尾法 3 3 5 5 3 3 5 5 DNA聚合酶和T4DNA连接酶 平末端DNA片段的连接 衔接物连接法 衔接物 linker 也叫接头 是有人工化学合成的一段10 12个核苷酸组成 具有有1个或几个限制性酶切位点的平末端的双链寡核苷酸短片段 GGATCCCCTAGG BamHI切割 GATCCG 连接酶 经BamHI切割的pBR322 GCCTAG BamHI衔接物 dsDNA GGATCCCCTAGG GGATCCCCTAGG 连接酶 重组DNA分子 GATCCG GCCTAG 如何避免单酶切后产生的相同的粘末端或平末端的自身环化 一 大肠杆菌DNA聚合酶I 二 Klenow片段酶 三 T4DNA聚合酶 四 逆转录酶 反转录酶 三 DNA聚合酶及其应用 一 大肠杆菌DNA聚合酶I E ColiDNApolI 是KornbergA 1956年首先从大肠杆菌E Coli细胞中分离出来的 它是一种多功能性的酶 包括3种不同的酶活力 5 3 聚合酶活性 模板 带3 OH游离基团的引物 4dNTPs Mg2 双链特异性的5 3 核酸外切酶活性3 5 核酸外切酶活性 从游离的双链或单链DNA的3 端降解 不过对于双链的降解可被5 3 的多聚活性所抑制 主要是校正作用 CCGGGCTATCGGA A T A G CCT CCGATAGCCTGGCTATCGGA CCGATAGCCTGGCTA T 大肠杆菌DNA聚合酶I的三种用途 A 利用缺口转移法制备高比活度的DNA探针利用其5 3 的外切酶活性及其聚合酶活性 B 用于DNA连接前的大缺口填充利用5 3 的聚合酶活性 C 用于DNA的序列分析利用5 3 的聚合酶活性 大肠杆菌聚合酶I的应用示例 缺口平移法制备探针 PolI Mg2 32P dNTPs 二 Klenow片段酶 Klenow片段是大肠杆菌聚合酶I全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段酶分子 分子量为76KD 酶催活性 5 3 的聚合酶活性 3 5 的核酸外切酶活性 CCGATAGCCTGGCTA Klenow片段的主要用途 利用5 3 的聚合酶活性 修补限制性酶消化DNA形成的3 隐蔽末端 标记DNA片段的末端底物用 32P dNTPs cDNA克隆中第二链cDNA的合成 DNA序列的测定 三 T4DNA聚合酶 T4DNA聚合酶是从T4噬菌体感染了的大肠杆菌中分离出来的 酶催活性 5 3 的聚合酶活性 3 5 的核酸外切酶活性 其外切酶活性要比大肠杆菌聚合酶I的活性高200倍 比Klenow片段酶强100 1 000倍 因此 可以综合利用这两种活性进行取代合成反应 如果反应体系中仅存在一种dNTP或没有底物时 这时T4DNA聚合酶就会表现出3 5 外切酶活力 从双链DNA的3 开始降解 直到露出底物dNTP相同的碱基 然后就在此位置发生合成和取代反应 CGTCGCGCAGCG CGTCGCGCAGCG dTTP Mg CGTGCAGCG 32P dNTPs Mg T4DNA聚合酶的用途 1 利用取代合成反应制备探针2 标记具有平末端的或具有3 隐蔽末端的DNA片段利用较强的3 5 外切酶活性和5 3 聚合活性3 用于DNA序列分析 双脱氧终止法对长片段DNA进行测序的理想用酶 四 逆转录酶 Reversetranscriptase 逆转录酶是一种依赖RNA的DNA聚合酶 1970年H M Temin 美 和D Baltimore 美 同时分别从禽成髓细胞瘤病毒和鼠白血病病毒中发现了AMVRT和Mo MLVRT 1975年二人共获诺贝尔生理 医学奖 目前两个酶已经商品化生产 功能 多功能酶 主要有三种酶活性 依赖于RNA的DNA聚合酶功能 RNaseH功能 水解DNA RNA杂交分子中的RNA链 依赖于DNA的DNA聚合酶功能 AMV RT与Mo RT在结构 作用特点上不完全相同 在cDNA文库构建中讲述 oligo dT 5 3 DNA链 3 5 RNA E活性14dNTP 3 5 RNA链DNA链 RNaseH 活性2 E 活性3 4dNTP 3 ds DNA5 5 3 3 ds DNA5 5 3 SI核酸酶 一 末端转移酶 terminaltransferase 二 SI核酸酶 SInuclease 三 碱性磷酸酶 四 修饰性工具酶 一 末端转移酶 末端转移酶是一类不依赖于DNA模板的DNA聚合酶 特性 该类酶可以