论文(初稿6-15日2225).doc

沈阳农业大学学士学位论文 目录目录 摘要 摘要 2 ABSTRACT 3 前言前言 4 1 1 孤雌激活的研究概况孤雌激活的研究概况 4 2 2 卵母细胞孤雌激活的分子机理 卵母细胞孤雌激活的分子机理 5 3 3 卵母细胞孤雌激活的方法 卵母细胞孤雌激活的方法 5 3 1 卵母细胞的电激活 6 3 2 卵母细胞的乙醇和氯化锶激活 6 3 3 卵母细胞的蛋白质合成抑制剂的激活 6 3 4 卵母细胞的钙离子载体 A23187 和离子酶素 IONOMYCIN 7 3 5 卵母细胞的精子因子 SF 或 SOAF 7 3 6 其它 7 4 4 卵母细胞孤雌激活的研究意义发展前景及存在的问题 卵母细胞孤雌激活的研究意义发展前景及存在的问题 7 正文正文 8 1 1 材料与方法 材料与方法 8 1 1 材料 8 1 1 1 实验动物 8 1 1 2 实验试剂 8 1 1 3 实验仪器 8 1 1 4 手术器械 9 1 2 方法 9 1 2 1 实验试剂的制备 9 1 2 2 小鼠卵母细胞的获取 9 1 2 3 电激活处理小鼠卵母细胞 10 1 3 活化鉴定及记录 10 1 4 统计学分析 10 2 2 结果结果 10 2 1 不同场强对小鼠卵母细胞电激活效果的影响 10 2 2 不同脉冲宽度对小鼠卵母细胞电激活效果的影响 11 2 3 不同脉冲次数对小鼠卵母细胞电激活效果的影响 11 3 3 讨论讨论 12 4 4 结论 结论 13 参考文献参考文献 13 致谢致谢 14 小鼠卵母细胞的电激活 1 摘要摘要 孤雌激活也叫孤雌生殖 孤雌激活最早始于 20 世纪 30 年代对兔卵的研究 对小鼠卵母细胞孤 雌激活的研究大概在 20 世纪 40 50 年代 半个多世纪来 关于小鼠卵母细胞电激活的报道已经很 多 但 目前在国内还未见有关于使用 ET 3 GOKU 日本富士平公司 激活卵母细胞的报道 本 实验以昆明系小白鼠 大连医科大学试验动物中心提供 为研究动物 采用日本富士平公司的 ET 3 电激活仪对小鼠卵母细胞进行人工孤雌激活 并从场强 电脉冲宽度 脉冲次数三个方面来探讨其 电激活率 发育阶段的影响情况 结果表明 在场强为 183V mm 脉冲宽度 10 s 2 次脉冲 脉 冲间隔为 50ms 刺激下其激活率和 2 4 细胞发育率较高 关键字 关键字 卵母细胞 电激活 小鼠 2 Abstract Keywords Ovocyte Electrical activation Mouse 小鼠卵母细胞的电激活 3 前言前言 1 1 孤雌激活的研究概况孤雌激活的研究概况 孤雌激活 parthenogenetic Activition 也叫孤雌生殖 parthenogenesis 最早 由owen提出 是指有性生殖动物的卵母细胞在精子以外的刺激下 由第二次减数分裂中 期 second meiometaphase MII期 继续发育 排出第二极体 PB 从而产生二倍体染 色体胚胎的过程 即在没有雄性参与 由单个卵细胞产生个体的繁殖 1 后又重新定 义为无雄性配子的任何作用 由雌性配子产生的胚胎 不论其是否发生成个体 称为 孤雌生殖 2 这一现象在无脊椎动物和低等脊椎动物中较为常见 自然条件下 卵母细 胞激活是由精子穿入刺激引起的 在人工因素的刺激下也可使处于MII期的卵母细胞完 成减数分裂 排出第二极体并发生卵裂 现在已发现有许多人工方法 如电脉冲 乙醇 磷酸肌醇脂和钙离子载体A23187等均可使小鼠 牛 仓鼠 大鼠 猪等的卵母细胞发 生孤雌激活 3 研究哺乳动物卵母细胞激活将加深人们对胚胎发生过程中的许多机理 性的认识 诱导哺乳动物孤雌发育的试验研究始于20世纪30年代 Pincus等采用改变温度和 渗透压的方法激活兔卵 成功地获得卵裂 并报道移植后产生了家兔后代 但这一结 果至今未能被重复 20世纪40年代和50年代 以Thibault Chang和Auotin为代表 采 用温度 渗透压和麻醉剂激活小鼠 大鼠 仓鼠 家兔 雪貂和绵羊卵母细胞 进行 孤雌发育研究 20世纪60年代该领域的研究经历了一个低潮时期 20世纪70年代重新 崛起 大多研究者着眼于提高孤雌激活率和发育率的方法学研究 采用电刺激或酶激 活方法刺激小鼠卵 获得较高的激活率和卵裂率 4 20世纪80年代以来研究不断深入 尤其是进入90年代 随着哺乳动物细胞核移植研究的开展 卵母细胞的孤雌激活得以 较为系统的研究 在实验动物 家畜及人卵母细胞激活方面均有较大进展的 特别是 1997年克隆羊 多莉 的产生 体细胞核移植获得成功 作为核移植关键步骤的受体 卵母细胞激活引起了更多研究者的重视 使该领域的研究进入了新的阶段 5 目前 在人工诱导雌核发育的鱼中 获得了能够正常受精的雌性个体 并成功地得到了人工 雌核发育的第二代和第三代 6 相比之下 哺乳动物孤雌生殖的研究还处于摸索阶段 尚未取得突破性进展 我国对脊椎动物人工单性繁殖的研究报告始见于1935年 朱洗 等由蛙子宫取出蛙卵 使其卵粘膜有蛙血后用细针刺激 结果其中有十分之一左右的 卵像受精卵一样进行正常卵裂 并获得两只单性繁殖蛙 目前 我国在人工诱导雌核 发育的鱼中也取得了较大进展 人工诱导鲤鱼核发育和建立纯系方面己获得成功 对 于哺乳动物卵母细胞孤雌激活的系统研究 直至近年来由于研究细胞核移植才开始有 所触及 现在也已进入系统化研究阶段 并取得一定成果 4 2 2 卵母细胞孤雌激活的分子机理 卵母细胞孤雌激活的分子机理 在受精时 卵子的激活与成熟促进因子 MPF 的失活是由一系列的细胞内Ca2 多次 持续波动引起的 7 这些Ca2 多次持续波动是细胞周期恢复所必须的 人工孤雌激活可 以模拟受精过程 使得孤雌激活的卵母细胞与受精卵有相似的生理变化 卵母细胞激 活过程中 细胞内Ca2 节律性脉冲升高起关键介导作用 Ca2 波动是启动卵母细胞周期 和继续发育的前提 直接注射Ca2 或用Ca2 载体A23187 乙醇 电刺激 Sr2 刺激均能 引起卵母细胞质内Ca2 多次波动性升高 卵母细胞内Ca2 升高产生膜的超极化反应 皮 质颗粒释放至卵周隙导致染色体解聚 启动减数分裂排出第二极体 促进原核形成 卵裂和早期胚胎发育 8 卵母细胞M 期的维持与高水平的成熟促进因子 MPF 活性有关 MPF的活性是由 对Ca2 非常敏感的细胞静止因子 CSF 来维持的 M 期卵母细胞受精激发卵内Ca2 升 高 破坏己存在的CSF 导致MPF活性降低 亚胺环己铜 CHX 是一种蛋白质合成抑制 剂 可以使小鼠和牛的卵母细胞孤雌活化 CHX与其他因素协同促进卵母细胞活化的作 用机制为乙醇 电脉冲和氯化锶的刺激已经导致卵母细胞的活化 随后的CHX作用又进 一步抑制了卵内新生的相关蛋白质合成 使之不能产生新的CSF 和MPF 使MPF一直处 于低水平 进一步促进了卵母细胞的活化 CHX引起的卵母细胞活化不是通过Ca2 波动 起作用 而是通过抑制有关蛋白质新的合成起作用 9 Cyclin B 和P34cdc2分别是MPF的调节亚基和催化亚基 由于P34cdc2的含量在整个细 胞周期中几乎保持恒定的水平 而cyclin B则是随着细胞周期的变化在不断的变化 所以Cyclin B就成了决定MPF活性的主要因素 2 Cyclin B在细胞间期开始合成 在 G2 M达到高峰 M期结束即被水解 Cyclin B的合成与分解处于一种动态平衡中 诸如 CHX等蛋白合成的抑制剂主要就是通过抑制Cyclin B的合成来控制这种平衡的状态 也 就影响到卵母细胞处于M 所必须的CSF和MPF的合成 最终致使MPF活性下降 引起卵 母细胞的活化 10 现在的研究表明 在卵母细胞激活过程中 细胞膜内外信号转导途径之一的蛋白 激酶C PKC 通路也起着重要的作用 细胞膜上的4 5 二磷酸酯酰肌醇 PIP2 在磷酸 二醋酶 PDE 作用下水解为1 4 5 三磷酸肌醇 IP3 和1 2 二酰基甘油 DAG IP3 刺激内质网内Ca2 库释放Ca2 Ca2 和DAG共同刺激PKC PKC磷酸化底物蛋白使其活化 与激活和减数分裂有关的蛋白的活化导致卵母细胞激活和减数分裂的恢复 11 3 3 卵母细胞孤雌激活的方法 卵母细胞孤雌激活的方法 卵母细胞在IVM后可通过多种方法使其激活卵裂 由细胞转变为胚胎 按激活性质 可大致将小鼠卵母细胞孤雌激活的方法划分为物理激活 化学激活和生物刺激法三类 物理激活包括 机械刺激 即卵母细胞的体外操作和穿刺处理 温度刺激 即低温和 高温处理 电刺激处理 后续将详细阐述电刺激法 等 化学激活包括 酶刺激如采用 透明质酸酶或链霉蛋白酶处理 渗透压即低渗和高渗处理 离子如二价阳离子 Sr2 或离子载体 如A23187 处理 麻醉剂 如全身麻醉和局部麻醉的药物 乙醇处理 蛋 白质合成抑制剂 如放线菌酮即CHX 蛋白磷酸化抑制剂处理 如6一二甲氨基嘌呤即6 小鼠卵母细胞的电激活 5 一DMAP 等 生物刺激 如精子提取物即精子因子等 最常用的是乙醇 电刺激 二 价阳离子 蛋白合成抑制剂等 12 3 3 1 1 卵母细胞的电激活卵母细胞的电激活 电刺激是目前应用最广泛的卵母细胞激活方式之一 电激活 亦称电刺激 卵母 细胞的原理是通过电脉冲激活卵母细胞 即在瞬间高压直流电脉冲作用下 细胞膜被 击穿 使卵母细胞上生成可逆性的微小孔洞 13 细胞内外的离子和大分子物质发生短 暂性的流动 细胞质内Ca2 浓度升高产生膜的超极化反应 皮质颗粒 CG 释放至卵周 隙导致染色体解聚 启动减数分裂器排出第二极体 原核形成 卵裂发生及胚胎早期发 育 卵细胞电激活的深一层机理可以解释为 细胞Ca2 浓度的升高对成熟促进因子 maturation promating fator MPF 和细胞静止因子 cell static fator CSF 活性的影响 正常情况下 MPF可实现细胞从间期到分裂期的转变 成熟卵子受到对 Ca2 敏感的CSF抑制作用而停留在第二次减数分裂中期 second meiometa phase MII 且CSF的这种作用是通过稳定MPF的活性而实现的 14 胞质Ca2 浓度的升高使MPF和CSF 水平下降或消失 从而引起卵子活化 促使卵母细胞离开MII期 完成减数分裂 从而 激活卵母细胞 15 通过控制电刺激参数 模拟正常受精过程Ca2 的节律性脉冲升高 可复制出正常受精过程的一系列生理学和形态学变化 启动M 期卵继续成熟分裂 步 入正常发育轨道 电刺激下卵母细胞电激活率与卵母细胞的卵龄 电场强度 脉冲持 续时间及脉冲次数有关 但各种动物在这些参数上存在差异 16 3 3 2 2 卵母细胞的乙醇和氯化锶激活卵母细胞的乙醇和氯化锶激活 乙醇是发现较早的一种化学激活剂 其激活的原理是通过水解细胞膜上4 5二磷 酸磷脂酰肌醇 PIP2 产生1 4 5三磷酸肌醇 IP3 诱发细胞内源钙释放到细胞质 提高了细胞胞内的钙浓度来实现 Machaty 等 1998 此类激活剂可改变卵膜的稳定性 使钙库的Ca2 释放出来以及增加细胞外Ca2 的渗入 经7 8 乙醇的培养液中培养 5 7min后处理过的小鼠卵母细胞 与精子受精一样细胞内Ca2 出现有规律地多次升高 在出现胞质Ca2 变化的卵中 Ca2 脉冲升高次数不尽一致但波形相似 将其培养可形成 原核 而未出现Ca2 升高反应的卵母细胞不形成原核 17 0 neill 等用氯化鳃 SrCI2 处理卵母细胞 Sr2 可进入钙库置换 Ca2 使胞质 Ca2升高 引发一系列依赖 Ca2的生理反应 对卵起激活作用 关于 Sr2 引发卵母细胞 内 Ca2波动的报道多见于小鼠 后来发现 Sr2 所引起的 Ca2的波动持续时间较长 当联 合 CHX 处理小鼠卵母细胞时 孤雌激活胚的发育能力更好 18 已经有人证明 Sr2 的刺 激能引起卵母细胞质内 Ca2 发生多次波动性升高 这可能是在细胞内 Sr2 不被消耗但 同时又可模拟 Ca2 而诱发内源性 Ca2 的释放 其诱发的 Ca2 波动与正常受精过程中 Ca2 的波动极为相似 尽管 Sr2 可诱导卵母细胞的激活 但对 Sr2 作用的研究目前 仅限于此 19 6 3 3 3 3 卵母细胞的蛋白质合成抑制剂的激活卵母细胞的蛋白质合成抑制剂的激活 在蛋白质类细胞因子如成熟促进因子 MPF 和细胞静止因子 CSF 的作用下 卵 母细胞分裂停滞在第二次成熟分裂中期 M 这些因子对Ca2 十分敏感 当卵激活胞 质Ca2 升高到一定水平时 MPF和CSF 便失活或消失 使用蛋白质合成抑制剂如离子霉 素或亚胺环己铜等激活卵母细胞时 可直接抑制这些蛋白质类细胞因子的合成 使卵 母细胞从M 期休止状态解脱出来 恢复第二次成熟分裂 18 3 3 4 4 卵母细胞的钙离子载体卵母细胞的钙离子载体 A23187A23187 和离子酶素和离子酶素 Ionomycin Ionomycin 钙离子载体 CaA A23187主要通过胞质内Ca2 释放来实现其激活功能 20 同时还抑 制蛋白的合成 因为卵母细胞在CaA处理后大多阻滞于带有两个极体的中期相 即Ml期 所以CaA常和CHX 6 DMAP联合使用 离子酶素 Ionomycin作为另一种钙离子载体 也是通过动员钙库释放Ca2 而发挥功 能的 与乙醇相比 由于它仅动用钙库内的Ca2 所以引起的Ca2 波动较为平缓 因而 效率更高 Ionomycin也常和6 DMAP联合使用 在激活率 原核形成以及孤雌激活胚囊 胚发育率上都有提高 21 3 3 5 5 卵母细胞的精子因子卵母细胞的精子因子 SF SF 或或 SOAF SOAF 有研究者利用精子的提取物 精子因子Sperm Factor 来激活卵母细胞 SF 在注 入卵母细胞质后可以触发类似于自然受精时的连续性的Ca2 波动 在小鼠 猪 人上都 可以取得激活效果 22 精子引发Ca2 波动是由于多种物质作用产生的结果 而SF的激 活效果只与精子发育时间 品种和SF的提取过程有关 SF注射到卵母细胞后所引发的 Ca2 波动与受精极为相似 且激活率高 但也有囊胚发育率不高的缺点 可能是由于注 入时细胞的损伤 SF的污染 失活造成 23 3 3 6 6 其它其它 Thioerosal THI 是一种氧化剂 并不刺激产生IP3而是对IP3进行修饰 从而引发 激活 24 联合Dithiothreitol DTT 后则可修正纺锤体的损伤 在猪卵母细胞上 THI 处理后大部分可以排出第二极体 联合DTT后 可刺激猪卵母细胞体细胞核移植胚发育 至囊胚 25 4 4 卵母细胞孤雌激活的研究意义发展前景 卵母细胞孤雌激活的研究意义发展前景及存在的问题及存在的问题 进行卵母细胞激活是家畜显微受精和细胞核移植的关键技术环节 也是研究哺乳 动物孤雌生殖及受精机制的重要手段之一 卵母细胞激活和孤雌发育与胚胎细胞核移 植成功密切相关 因为移核后的卵母细胞的核物质被胚胎细胞核所代替 移入的核物 小鼠卵母细胞的电激活 7 质的复制等过程完全依赖于卵母细胞的激活 因此卵母细胞激活和孤雌胚发育的研究 对于完善细胞核移植技术有着重要的意义和价值 研究哺乳动物卵母细胞的激活及尔后的孤雌发育 对了解哺乳动物早期胚胎发育 有重要意义 有利于探索卵母细胞的生理反应 分析理化激活与精子激活的特征 检 测孤雌胚与正常胚胎的蛋白质合成 观察孤雌胚与受精胚的嵌合和发育能力 分析雄 性和雌性基因组在个体发育中的作用 有助于了解哺乳动物早期胚胎发育的机理 对 阐明哺乳动物卵的激活 受精和发育机理 解答这些重要的生命现象及技术的应用具 有重要意义 利用卵母细胞的徽活及孤雌胚发育技术 达到建立生产孤雌哺乳动物品 系的方法 从而为加速家畜育种进程提供有力的手段 目前 有关哺乳动物孤雌激活的理论基础还比较薄弱 一般生物化学的 细胞生 物学的和分子生物学的研究正在进行之中 人们期待着立足于坚实的基础理论研究 不断地提高诱导孤雌发育的效率 随着这些研究的不断深入和拓展 可以预料 人们 能更广泛地利用孤雌卵母细胞的激活及孤雌胚的发育技术 研究动物个体发育 细胞 分化 并为核移植技术和动物克隆技术深入细致的研究奠定基础 达到建立生产孤雌 哺乳动物品系的方法 从而为加速家畜育种进程和其他生物工程的应用提供有力地依 据 正文正文 1 1 材料与方法 材料与方法 1 11 1 材料材料 1 1 11 1 1 实验动物实验动物 购自大连医科大学试验动物中心 合格证号 SCXK 辽 2004 0017 的 6 8 周龄 体重 20 25g 左右雌性昆明小白鼠 饲养在人工控温 22 24 和人工光照 6 00 20 00 光照 20 00 6 00 黑暗 条件下 自由饮水 采食 饲料为 1 1 21 1 2 实验试剂实验试剂 1 孕马血清促性腺激素粉剂 PMSG 宁波激素制品厂 2 人绒毛膜促性腺激素粉剂 hCG 宁波激素制品厂 3 无 Ca2 Mg2 的 PBS 冲卵液 Sigma 4 M2 KSOM 5 矿物油 Hepes BSA 甘露醇 透明质酸酶等皆为 Sigma 产品 8 1 1 31 1 3 实验仪器实验仪器 1 细胞融合仪 ET 3 GOKU 日本富士平公司 2 CO2培养箱 Galaxy B RS Biotech 5500E 天美 4950E 天美 3 体视显微镜 SMZ 168 Motic 4 立式自动电热压力蒸汽灭菌器 LDZX 40B 型 上海申安医疗器械 5 自动三重纯水蒸馏器 SZ 97 上海亚荣生化仪器厂 6 恒温板 7 自制的吸胚管 8 培养皿 35mm 9 1ml 注射器 10 电极针 11 酒精灯 1 1 41 1 4 手术器械手术器械 眼科镊 2 个 眼科剪 2 把 大镊子 2 个 杀鼠垫板 1 个 1 21 2 方法方法 1 2 11 2 1 实验试剂的制备实验试剂的制备 正式实验开始前两三天将 M2 KSOM 的配好备用 配制过程见附表 用去离子 水配置 然后用分离式磁力加温搅拌器振荡至完全溶解 定容至 100mL 经 0 22 m 的滤膜过滤除菌后 用封口膜封好瓶口 4 下保存 培养液微滴的制备 用 1mL 注射器吸取培养液 在培养皿中制成小滴 用事先在 37 5 CO2条件下平衡好的矿物油覆盖 使用前放至 37 5 CO2条件下的培养箱 中平衡 1h 1 2 21 2 2 小鼠卵母细胞的获取小鼠卵母细胞的获取 M 期卵母细胞通过超数排卵获得 小鼠于18 00腹腔注射孕马血清促性腺激素 Pregnant mare serum gonadotrophin PMSG 5 0IU 只 48小时后注射同剂量的人 绒毛膜促性腺激素 human chorionic gonadotrophin hCG 于次日早9 00 即hCG注 射15h后 采用颈椎脱臼法处死小鼠 用酒精喷洒消毒后放置于已经消毒过的实验台上 解剖小鼠 无菌取出两侧的输卵管 将取出输卵管置于M2液中 在实体显微镜 Motic 下用一次性1mL注射器小心划破小鼠输卵管壶腹部 将卵丘 卵母细胞复合体 小鼠卵母细胞的电激活 9 Cumulus enclosed Oocyte Complexes COCs 轻轻挤出 用巴氏吸管将收集的COCs 移置于0 1 的透明质酸酶并消化3 5分钟 脱去卵母细胞周围的卵丘细胞 再经M2液洗 涤3次将裸卵 DO 移入置盛有电激液 electrical activation solution EAS 由 0 3mol L甘露醇 0 01Mgcl2 0 1mmol LCacl2 0 0119 0 05 BSA组成 的培养皿 将培 养皿放在上述培养箱中备用 1 2 31 2 3 电激活处理小鼠卵母细胞电激活处理小鼠卵母细胞 将已在含有电激活液中培养了 3 5 分钟的小鼠卵母细胞移置于体积约为 50 L 的 电激活液液滴中使用电激活仪 ET 3 GOKU 富士平公司 Japan 作电激活处理 激活处 理后的卵子用 M2 液清洗 3 次后移入 KSOM 培养皿中 放在 37 5 CO2和饱和湿度的培 CO2养箱中进行体外培养 1 31 3 活化鉴定及记录活化鉴定及记录 凡卵母细胞中出现1个原核1极体 1PN 1PB 2原核2极体 2PN 2PB 2原核1极 体 2PN 1PB 或2 细胞各具1个原核者 均判定为被激活 卵质膜破裂者判定为死亡 卵母细胞无明显变化则全部归为退化 活化后24h 48h 72h各观察1 次 记录2 4细 胞 8 16细胞 桑椹胚与囊胚的发育情况 1 41 4 统计学分析统计学分析 以上每组实验均重复3次 实验所得资料采用SPSS统计软件进行显著性检验 对成 熟率进行单因素方差分析 多重比较用邓肯式法 以P 0 05时确定为差异不显著 P 0 05时确定为差异显著 P 0 01时确定为差异极显著 2 2 结果结果 2 12 1 不同场强对小鼠卵母细胞电激活效果的影响不同场强对小鼠卵母细胞电激活效果的影响 小鼠卵母细胞经不同场强 10 s脉宽 1 次脉冲激活处理后放在KSOM中培养 分别 于24h 48h 72h各观察1 次 记录2 4细胞 8 16细胞 桑椹胚的发育情况见表1 表表 1 1 不同场强对小鼠卵母细胞电激活效果的影响 不同场强对小鼠卵母细胞电激活效果的影响 Table 1 Effects of different pulse strength on the activation of mouse oocytes 发育阶段 development stage 场强 v mm Pulse strength 处理卵子数 n No oocytes Treated 激活数 No activation 2 4 细胞 2 4cell 8 16 细胞 8 16cell 桑葚胚 Morular 16798 3 11 0 1 04 67 0 573 33 1 520 21 0 57 10 21 2 183114 3 11 7 1 0 34 2 6 53 0 572 77 0 580 33 0 57 200105 3 10 6 1 52 22 9 5 00 1 002 13 0 580 从表1可以看出 场强为183V mm 200V mm时的激活率要高于167V mm 说明在一定 范围内提高电激活的场强有利于卵母细胞的激活 但经200V mm的场强刺激过的小鼠卵 母细胞2 4细胞 8 16细胞发育率都低于183V mm时的发育率 这可能是由于过高的场 强 使卵母细胞在激活中产生的微孔不能完全甚至不能恢复 引起卵母细胞胞体结构 的改变 从而影响了孤雌胚的后期发育 2 22 2 不同脉冲宽度对小鼠卵母细胞电激活效果的影响不同脉冲宽度对小鼠卵母细胞电激活效果的影响 小鼠卵母细胞经183V mm场强 不同的脉宽 1 次脉冲激活处理后放在KSOM中培养 分别于24h 48h 72h各观察1 次 记录2 4细胞 8 16细胞 桑椹胚与囊胚的发育情 况见表2 表表 2 2 不同脉冲宽度对小鼠卵母细胞电激活效果的影响 不同脉冲宽度对小鼠卵母细胞电激活效果的影响 Table 2 Effects of different pulse width on the activation of mouse oocytes 发育阶段 development stage 脉冲宽度 s Pulse duration 处理卵子数 n No oocytes Treated 激活数 No activation 2 4 细胞 2 4cell 8 16 细胞 8 16cell 桑葚胚 Morular 10104 3 33 0 58 A 17 2 8 67 0 57 11 2 0 67 0 58 3 0 0 15117 3 3 0 57 B 21 5 4 68 0 57 5 4 0 33 0 57 1 3 0 20103 3 67 4 92 B 11 6 3 00 1 00 2 1 0 33 0 57 0 8 0 注 上表同一列中的不同大写字母上标表示彼此间差异极显著 p0 05 从表 2 可以看出 脉冲宽度为 10 s 与脉冲宽度 15 s 20 s 下的卵母细胞激活 数之间差异极显著 p 0 01 脉冲宽度为 15 s 时的激活率虽然略高于 10 s 时激活 率 但脉冲宽度为 15 s 20 s 时的 2 4 细胞及 8 16 细胞的发育率都要低于 10 s 的脉宽 这说明一定范围内加大脉冲宽度虽然可以增加被激活卵母细胞的数目 但对 其的后期发育却产生不利 2 32 3 不同脉冲次数对小鼠卵母细胞电激活效果的影响不同脉冲次数对小鼠卵母细胞电激活效果的影响 小鼠卵母细胞经183V mm场强 10 s 脉宽 分别经1 2 3次脉冲激活处理后放在 小鼠卵母细胞的电激活 11 KSOM中培养 分别于24h 48h 72h各观察1 次 记录2 4细胞 8 16细胞 桑椹胚与 囊胚的发育情况见表3 表表 3 3 不同脉冲次数对小鼠卵母细胞电激活效果的影响 不同脉冲次数对小鼠卵母细胞电激活效果的影响 Table 3 Effects of different pulse warth on the activation of mouse oocytes 发育阶段 development stage 脉冲次数 n No Pulse 处理卵子数 n No oocytes Treated 激活数 No activation 2 4 细胞 2 4cell 8 16 细胞 8 16cell 桑葚胚 Morular 194 3 11 0 1 0 24 2 5 12 0 57 11 5 3 43 1 52 2 2 0 299 3 6 33 1 15 47 6 5 67 0 57 12 2 2 31 0 58 1 6 0 3103 3 6 67 1 52 51 5 6 33 1 15 4 06 1 33 2 08 0 4 0 从表3可以看出 2次及3次电脉冲的激活率明显高于1次电脉冲 P 0 01 说明多次 脉冲有利于卵母细胞的激活 但经3次电脉冲刺激过的小鼠卵母细胞的8 16细胞发育率 要低于经2次电脉冲过的卵母细胞 这可能是由于多次电脉冲对卵母细胞产生了损伤作 用 导致后期发育率的下降 说明多次脉冲虽然可以提高卵母细胞的激活率 但对起后 期的发育不利 因此以在小老鼠卵母细胞的电激活中 使用2次电脉冲刺激较为合适 3 3 讨论讨论 自然条件下 卵子的激活是由精子穿入刺激引起的 哺乳动物卵母细胞在受精过程 中因精子的激活作用 使细胞内的游离钙呈现多次有规律的脉冲升高 刺激处于M 期的 卵母细胞完成减数分裂 排出第二极体 并继续发育 1 在单一方法的人工孤雌激活方 法中 电激活还是目前被使用较多的一种激活卵母细胞的方法 其原理是细胞在短暂高 压直流电脉冲的作用下 膜上的磷酸二酯双分子的稳定性发生改变 产生暂时的微孔 细 胞内外的离子和大分子可通过微孔进行交换 从而使细胞外Ca2 内流 而电脉冲引起的 微孔大小又受脉冲强度 宽度 脉冲宽度等因素的影响 因此电脉冲激活卵母细胞效率 也受这些条件的影响 25 Zimmermann U 26 研究发现 脉冲宽度和电场强度之间存在互补关系 即降低电场强 度 则需要延长脉冲时间来弥补 而且穿孔的效率往往与电场强度和脉冲宽度的乘积成 正比 但对其解释仍很不完全 Onodera M 和Tsunoda Y 27 研究证实 场强1 5kV cm 持续时间25 s 二次脉冲刺激注射hCG后17h的小鼠卵母细胞 其激活率仅为19 但把 持续时间增加到150 s 时 激活率达到79 而当场强增加到2 5kV cm 时 持续时间仅 为50 s 就可获得85 的活化率 为了简化实验程序 本研究先在10 s 的脉宽一次脉 冲条件下 采用167V mm 200V mm范围的场强对小鼠的卵母细胞进行刺激 结果表明 卵 母细胞激活率随电场强度在一定范围内的增加而明显上升 这可能是由于强的电刺激 引起强的Ca2 内流 进而引发了更强的激活信号所致 28 但张德福等 29 研究表明当 场强增加到2 5kV cm时 激活率和卵裂率有下降的趋势 这可能是因为电场强度过大 会 使细胞膜上电激造成的孔洞不可逆 大量的Ca2 内流 细胞内Ca2 浓度过高 高浓度的 Ca2 会导致细胞内染色体的解离 核和染色体的不正常构建 从而致使卵母细胞死亡率增 12 加 细胞受到损伤 活化率下降 谭景和等 30 在2 0kV cm的最佳场强一次脉冲条件下 采用40 s 150 s大范围的脉宽对小鼠卵母细胞进行刺激 结果表明 确定场强的情 况下 激活率随脉冲时程的延长而升高 但脉冲时程过长或场强过高 则导致卵母细胞退 化 死亡增多 卵母细胞内Ca2 浓度升高是卵母细胞被激活的初始信号 而Ca2 浓度 变化对电刺激反应敏感 邹贤刚等 14 研究表明 单次电刺激可引起卵母细胞内出现一 次Ca2 波动 经5 min 6 min 后又降至基础浓度 而不像精子或某些化学试剂那样诱导 卵内Ca2 多次升高 多次电刺激可以诱导卵内Ca2 多次升高 而且多次瞬时高压电击可 使卵母细胞膜上间断性地形成很多可恢复的微小孔洞 介质或钙库内的Ca2 通过小孔进 入胞质 使细胞内Ca2 呈脉冲式升高 VitulloA D 等 31 模拟小鼠正常受精中Ca2 出现 的33次升高 使用33次不同参数的电刺激 获得几乎100 的激活率 他们认为 多次电脉 冲能引发钙离子多次内流 较真实地模仿了精 卵融合激发的卵内Ca2 的波动 本试验 的结果也表明 2次脉冲连续刺激 脉冲间隔50ms 与一次脉冲刺激相比 可显著 P 0 01 提高了小鼠卵母细胞的激活 4 4 结论 结论 在前人实验的基础上 本实验中对影响小鼠卵母细胞电激活效果的几个主要因素 进行了比较 从实验中所得数据可以看出当场强为 183v mm 脉冲宽度 10 s 2 次脉 冲 脉冲间隔为 50ms 刺激对小鼠卵母细胞电激活效果相对较好 然而影响卵母细胞 激活率的因素很多 而且任何一种因素都不可能独立存在 都是与其他因素相关联而起 作用的 在对小鼠卵母细胞的电激活的研究中 目前在国内还没有关于使用 ET 3GOKU 电激活仪对小鼠卵母细胞电激活的报道 所以 本实验中的结果仅供参考 参考文献参考文献 1 范必勤 邓满齐 哺乳动物卵的激活与孤雌发育 生物工程进展 1994 14 50 54 2 Kaufman MH Early mammalian development Parthenogeneticstudies Cambridge University Press 1983 20 83 3 Nussbaum D J Prather R S Differential effects of protein synthesis Inhibitors on porcine oocyte activation J Mol Reprod Dev 1995 41 70 75 41 陈大元等 受精生物学 科学出版社 2000 5 桑润滋主编 动物繁殖生物技术 M 北京 中国农业出版社 2002 6 营原七郎主编 张志超 徐春生主译 哺乳动物发育工程试验方法 M 南京 南京大学出版社 1994 7 Swann K Ozil J P Dynamics of the calcium signal that triggers mama1ian egg activation lnt Rev Cytol 1994 152 182 222 8 Igarashi H Takahashi E Hiroi M etal Aging related changes in calcium osci1lations in ferti1ized mouse oocytes J Molecular ReproductionDevelopment 1997 28 70 73 9 Sun QY Rubinstein S Breitbart H MAP kinaseactivity is down regulatedby phorbol ester during mouse oocyte maturation and egg activation J Molecular Reproduction Development 1999 52 310 318 小鼠卵母细胞的电激活 13 10 陈晓宇 猪卵母细胞的体外成熟与孤雌激活 硕士学位论文 西北农林科技大学 2003 11 Mitalipov S M White K L FarrarV R etal Development of nucleartransfer and Parthenogenetic rabbit embryos activated with in ositol l 4 5 trisPhosPhate J Blo Reprod 1999 60 4 821 827 12 EscibaM J Gareia XimenezF Influence of sequence duration and numberof e1ectica1 pu1sesu Ponrabbit oocyte activation and parthenogenetic invitro development J Anim Reprod Sic 2000 59 99 107 13 Zimmermamnn U Electric field medicted fusion and related electrical phenomena j Bilchim Biophys Acts 1992 22 227 233 14 邹贤刚 肖达 黄国屏 等 电刺激家兔卵母细胞孤雌活化的研究 J 动物学报 1993 39 78 80 15 赵浩斌 猪母卵细胞的电激活 J 西北农业学报 1999 8 1 15 19 16 EscribaM J Gareia Ximenez F Use of a variable e1ectrica1 pu1sing sequence In rabbit oocytes J Reprod Nutr Dev 2000 40 261 269 17 徐清华 兰旅涛 韦启鹏 哺乳动物孤雌生殖研究进展 江西农业学报 1997 9 2 60 64 18 Bos MikichA SwannK whittlngham DG Calcium oscillstions and proteinsynthesis inhibition synergistical1y activate mouse oocytes J Mol Reprod Dev 1995 41 84 90 19 袁水桥 罗光彬 张晓华 等 哺乳动物卵母细胞孤雌激活研究进展 J 动物科学与动物医学 2004 21 12 1 3 20 Kline D Kline JT Reprititive calcium transients and the ro1e of calcium in exocytosis and cycle activation in the mouse egg J Dev Biol 1992 149 80 89 21 Susko Parrish J L Leibfried Rutledge M L Morthey D L etal Inhibition of Protein kinases after an induced calciumt ransient causes transition of bovine oocytes to embryonic cyc1es without meiotic completion J Dev Biol 1994 166 729 73 22 Perry A C Wakayama T Cooke I M etal Mammalian oocyte activation by the synergistic action of discrete sperm head components induction of calcium transients and invo1vement of proteolusis J Dev