《微生物工程》期末个人总结资料.doc

发酵工程 第一章 绪论1、发酵定义：狭义发酵：微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的一种方式。（工业上）广义发酵：利用微生物在有氧或无氧条件下的生命活动，来制备微生物菌体本身或代谢产物的过程。2、微生物工程定义： 是指利用生物细胞的特定性状，通过现代化工程技术手段，在反应器中生产各种特定有用物质，或者把生物细胞直接用于工业化生产的一种工程技术系统。 分：上游工程和下游工程 上游工程：细胞的遗传特性、培养基配方、灭菌等 下游工程：产物提取、纯化、分离；废物利用等。3、微生物工程的基本流程（图示）4、微生物工程的发展转折点：第一个转折点：非食品工业第二个转折点：深层通气搅拌培养第三个转折点：代谢控制发酵近代转折点：基因、动物、海洋5、微生物工程的发展阶段：v 自然发酵时期v 纯培养时期v 通气搅拌和代谢控制时期（出现于20世纪40年代，以抗生素的生产为标志vv 基因工程时期不自觉地利用空气中的微生物进行混合发酵，所以称为自然发酵期Robert Koch 发明了固体培养基；建立了纯培养技术。 第二章 工业微生物菌种的选育与扩大培养一、发酵工业对微生物菌种的要求（1）高产目的代谢产物（2）生长繁殖能力强,发酵周期短。（3）能利用价格便宜,来源广泛的农副产品原材料,具备较低的工业发酵原料成本。（4）培养要求不高,培养条件易于控制。（5）发酵过程不产生或少产生非目标副产物.（6）具备稳定的遗传特性,不易变异和退化。（7）菌种不是病原菌，不产生有害的生物活性物质和毒素。二、工业生产常用微生物：枯草芽孢杆菌 生产大量淀粉酶和蛋白酶大肠杆菌 生产天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸等;乳酸杆菌 生产乳酸、干酪、乳脂的酸化和腌菜、泡菜等. 肠膜状明串珠菌 生产葡聚糖，使糖汁变粘而无法加工，为糖厂有害菌醋酸菌 生产醋酸细菌棒状杆菌 谷氨酸以其他氨基酸高产菌短杆菌 生产氨基酸、核苷酸，酶法合成生产辅酶A.黄单胞菌 以淀粉生产黄胶原假单胞菌 生产VB12、丙氨酸、谷氨酸、葡萄糖酸、色素、果胶酶；也能进行类固醇（甾体）转化；有些菌株可利用烃类生产单细胞蛋白。链霉菌属 多种抗生素小单胞菌属 多种抗生素放线菌：游动放线菌属 生产创新霉素诺卡氏菌属 生产利福霉素、蚊霉素孢囊链霉菌属 多霉素、创新霉酿酒酵母 发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和半乳糖等多种糖类，但不发酵乳糖和蜜二糖葡萄汁酵母与酿酒酵母相似，主要的区别在于葡萄汁酵母能发酵棉子糖和蜜二糖汉逊酵母 此酵母多能产生乙酸乙酯，从而增加产品的香味，可用于酿酒和食品工业球拟酵母 此属酵母有些种能产生不同比例的甘油、赤藓糖、阿拉伯糖；有的能利用烃类生产蛋白质。酵母菌假丝酵母 红酵母能形成假丝液培形成浮膜。可生产SCP甘油脂肪酶。可由菌体提取大量脂肪、b-胡萝卜素。棉病针孢酵母 具有大量合成核黄素的能力，是核黄素生产的重要菌种。毕赤氏酵母 能利用石油或农副产品及工业废料产生菌体蛋白根霉米根霉：淀粉酶活力极强；蛋白质分解能力强，制造腐乳华根霉：酿酒所必须的重要霉菌，也是酸性蛋白酶和腐乳生产中的重要菌种。毛酶鲁氏毛霉：能糖化淀粉且能生成少量酒精；能产生蛋白酶，常用来制作腐乳总状毛霉：是毛霉中分布最广的一种，酒曲中常见 ,可制作豆豉。霉菌曲霉黄曲霉：有较强的蛋白分解能力及糖化能力； 酿酒中的糖化菌；蛋白酶和淀粉酶的生产菌。黑曲霉：具有多种酶系，如淀粉酶等；能产生多种有机酸；是生产柠檬酸和葡萄糖酸的重要菌种。青霉产黄青霉:生产青霉素，也可用来生产葡萄糖氧化酶、葡萄糖酸、柠檬酸和抗坏血酸。娄地青霉 ：具有分解油脂和蛋白质的能力，用于制造干酪白地霉 菌体蛋白营养价值很高，可供食用和饲料用，也可用来提取核酸，在废料废水的利用上很用价值。产黄头孢霉 头孢霉素、先锋霉素三、 工业微生物菌种的分离和选育1）发酵工业水平发展的三个决定要素：生产菌种的性能、发酵和提取工艺条件、生产设备2）微生物菌种工作：菌种分离筛选、菌种培育、菌种保藏、菌种复壮3）分离与筛选菌种的基本步骤：样品采集富集培养筛选产物分析4）采样根据微生物的营养类型采样根据微生物的生理特性采样森林土中有相当多枯枝落叶和腐烂的木头，富含纤维素，适合利用纤维素作碳源的纤维素酶产生菌生长。肉类加工厂附近、饭店排污沟，易分离到蛋白酶和脂肪酶产生菌。面粉加工厂等场所易分离到产淀粉酶、糖化酶的菌。筛选产低温酶的微生物，可从冰窖、南极、深海等采样分离耐高渗透压酵母菌，可到甜果、蜜饯、甘蔗渣堆积处采样筛选产耐高温酶微生物温泉、火山喷发口、肥堆。5）含微生物样品的富集培养概念：富集(enrichment)培养： 目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利分离到所需的菌株。要领：促进目的菌生长，抑制杂菌生长方法：控制培养基的营养成分、控制培养的理化条件（温度、PH、盐度、氧气等等）、抑制其他微生物的生长（如加入抗生素）6）利用固体平板的生化反应进行分离：方法概念应用注意事项透明圈法在培养基中加入溶解性差的浑浊底物，能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。1、分离水解酶产生菌。如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、核酸酶产生菌2、在加入CaCO3的培养基中筛选产酸菌透明圈的大小不能完全作为选择高产菌的依据，因为在深层培养中的产酶单位与平板上圈的大小之间并不完全成正比。作为初筛还是有意义的变色圈法对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中加入指示剂或显色剂，使目的微生物菌落周围呈现变色圈，从而能被快速鉴别出来抑菌圈法将待检菌涂布于高浓度工具菌（抗生素敏感菌）若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈常用于抗生素产生菌的分离筛选.生长圈法将待检菌涂布于高浓度工具菌（营养缺陷菌）并缺少所需营养物的平板上进行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的生长圈通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌.7）目的微生物的筛选：A、初筛：从大量分离到的微生物中将具有合成目的产物能力的微生物筛选出来的过程。一般采用平板筛选和摇瓶筛选的方法。(一株一瓶)B、复筛：是将初筛所得到的菌株接种到三角瓶中做摇瓶培养，然后对其培养液进行定量分析测试，最后从中选出较为优质可靠的菌株2-3株。（重复：1株3-5瓶）四、工业微生物菌种选育1）菌种选育应用微生物遗传和变异理论，用人工方法(或自然)造成变异，再经过筛选以得到人们所需菌种的过程。2）选育方向： 吃粗粮”、耐高温、生长快、代谢旺、产量高、质量好、无毒性的优良菌株3）工业微生物菌种选育方法：A、自然选育 概念：不经人工处理，利用微生物的自发突变进行菌种选育的过程。 原因: 多因素低剂量的诱变效应And互变异构效应 (四种碱基第六位上的酮基或氨基的瞬间变构，会引起碱基的错配) 结果：菌种退化而导致目标产物或质量下降 OR对生产有益的突变B、诱变育种 概念：用物理或化学的诱变剂使诱变对象内的遗传物质（DNA）的分子结构发生改变，引起性状变异并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。 诱变剂：凡能引起生物体遗传物质发生变异的因素。 使用剂量：诱变率往往随诱变剂剂量的增高而增高，但达到一定程度后，再提高剂量，反而会使诱变率下降。目前处理剂量为致死率的70-80% 处理方式：C、杂交育种：包括常规杂交育种，和原生质体融合D、分子育种：包括基因工程育种和分子克隆育种4）诱变育种的突变诱发过程： A、诱变剂接触DNA分子之前：穿过细胞壁细胞质；与基因所处的状态有有关，基因转录时有利于诱变。B、DNA损伤修复：5种光复活修复、切补修复、DNA多聚酶的校正作用具差错校正性质、不利于突变诱发Sos修复、重组修复具有引起差错的性质，利于突变发生C、从前突变到突变。 前突变诱变剂所造成DNA分子的某一位置的结构改变D、从突变到突变型。 突变基因的出现并不等于突变表型的出现，表型的改变落后于基因型的改变。迟延现象： 分离性迟延：经诱变剂处理后，细胞中的基因处于不纯的状态，突变型基因由于属于隐性基因，暂时得不到表达，需经过复制、分离、在细胞中处于纯的状态时，其性状才得以表达。生理性迟延：突变基因由杂合状态变为纯合状态时，还不一定出现突变表型，新的表型必须等到原有基因的产物稀释到某一程度后才能表现出来，而这些原有基因产物的浓度降低到能改变表型的临界水平以前，细胞已经分裂多次，经过了好几个世代。 诱变育种中，细胞一般采用生理状态一致的单倍体、单核细胞，即菌悬液的细胞应尽可能达到同步生长状态。细胞要求培养至对数生长期，此时群体生长状态比较同步，比较容易变异，重复性较好为什么就要制备单细胞悬液？原因如下1)分散状态的细胞可均匀地接触诱变剂； 2）可避免长出不纯的菌落。单细胞悬液，霉菌孢子或酵母菌细胞的浓度大约为106-107个ml，放线菌和细菌的浓度大约为108个ml。后培养：由于表型迟延现象的存在，必须在完全培养基中进行培养才能稳定变异，使菌株表现出高的突变频率。筛选：初筛和复筛诱变育种的优缺点：具有速度快，收效大，方法简便等优点，是当前选育菌种的一种主要方法；但是诱发突变缺乏定向性。5）杂交育种：两个不同基因型的菌株通过接合或原生质体融合使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选出具有新性状的菌株。具有定向育种的优点。6）原生质体融合：l 概念：将两个亲本的细胞去掉细胞壁，获得原生质体，将两亲本的原生质体在高渗条件下混合，由聚乙二醇（PEG）作为助融剂，使它们互相凝集，发生细胞质融合，两亲本基因组由接触到交换，从而实现遗传重组。l 优点：大幅度提高亲本之间重组频率；扩大重组的亲本范围原生质体融合时亲本整套染色体参与交换，遗传物质转移和重组性状较多，集中双亲优良性状机会更大。可以和其它育种方法相结合，把由其他方法得到的优良性状通过原生质体融合再组合到一个单株中。l 五大步骤：直接亲本及其遗传标记选择双亲本原生质体制备与再生亲本原生质体诱导融合融合重组体（融合子）分离遗传特性分析与测定l 原生质的制备方法：酶解法细菌、放线菌 溶菌酶 酵母菌 蜗牛酶 霉菌 纤维素酶，多糖酶等l 影响原生质体制备的因素：菌体预处理（如用EDTA处理？）菌体的培养时间（对数期后期为宜）酶浓度（原生质体形成率与再生率的乘积达最大时的酶浓度为最适酶浓度）酶解时间（太短酶解不充分，太长原生质体再生率下降）酶解温度渗透压稳定剂（一般在高渗溶液或等渗溶液中）酶解方式（摇动、补足氧气，使菌体处于正常生长状态）不同菌种，使用的渗透压稳定剂也不一样：细菌、放线菌一般采用蔗糖、丁二酸钠酵母采用山梨醇、甘露醇霉菌采用KCl和NaCll 原生质体的活力检测方法：低渗爆破法 荧光染色法l 原生质体的收集与纯化方法：过滤法密度梯度离心法界面法漂浮法l 原生质体的再生：大分子物质合成与原生质体的生长细胞壁的再生分裂能力恢复l 影响原生质体再生的因素：菌体生理状态（年轻C强于年老C） 稳定剂（高渗溶液） 酶浓度 及酶解时间 残存菌体的分离（活力强的菌体先形成菌落抑制活力弱的原生质体的再生和菌落生成）原生质体的密度（密度不宜过打，否则先形成菌落的会抑制后形成的菌落的生长）排除再生培养基上的冷凝水（水会降低渗透压，引起原生质体的涨裂）再生方法：双层平板法l 如何求原生质体的形成率和再生率？A：酶解前用无菌水稀释涂平板计数得到菌总数B：酶解后用无菌水稀释涂平板法计数得到的为未形成原生质体的细胞数目C：酶解后用高渗溶液稀释涂平板计数得到的为原生质体再生的菌数和未形成原生质体的原菌数之和则：l 原生质体融合后会产生两种情况： 一是真正的融合，即产生杂合二倍体或单倍重组体 二是暂时的融合，形成异核体。两者均可在选择培养基上生长，一般前者较稳定，后者不稳定，会分离成亲本类型，有的甚至可以异核状态移接几代。 因此要获得真正的融合子，必须在融合体再生后，进行几次自然分离选择，才能确定。l 灭活原生质体融合技术采用热、紫外线、电离辐射以及某些生化试剂、抗生素等作为灭活剂来处理单一亲株或双亲株的原生质体，使之失去再生能力，经细胞融合后，由于损伤部位的互补可以形成能再生的融合体。五、种子扩大培养l 种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。l 种子扩培的作用：集团优势，抑制其它杂菌的侵染；在大罐上实现细胞生长繁殖速度快，缩短发酵周期；使生产菌种逐步适应大生产的培养条件。l 种子的准则：细胞生长活力强，同步性较好，移种至发酵罐后能迅速生长，延滞期短; 生理性状稳定，保持稳定的生产能力;菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求;无杂菌以及噬菌体污染l 种子扩培两个阶段：实验室种子制备阶段：琼脂斜面、固体培养基扩大培养、摇瓶液体培养生产车间种子制备阶段：种子罐扩大培养 实验室种子制备：实验室种子制备产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种固体培养基培养孢子孢子可直接作为种子罐的种子产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种液体摇瓶培养获得菌丝体，作为种子不产孢子的细菌将试管斜面菌种接入茄瓶斜面或摇瓶培养。细菌孢子的制备：多采用碳源限量而氮源丰富的配方。 霉菌孢子的制备：一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。 放线菌孢子的制备：一般采用琼脂斜面培养基 生产种子制备：种子罐级数制备种子需逐级扩大培养的次数。一般根据菌种生长特性、菌体繁殖速度以及所采用发酵罐的容积而定一级发酵：在小型罐（5500L）中进行实验时，通常采用直接将孢子或菌丝体接入罐中发酵。一级种子罐扩大培养，二级发酵：对生长快的细菌，将摇瓶培养的种子接入种子罐培养一段时间后，即可接入发酵罐作为种子。二级种子罐扩大培养，三级发酵：对生长慢的细菌，孢子悬液接入一级种子罐培养一段时间后，再移至具有新鲜培养基的二级种子罐培养一段时间后，即可接入发酵罐作为种子。一般50m3发酵罐都采用三级发酵。三级种子罐扩大培养，四级发酵：对于生长更慢的细菌种子罐级数越小，越有利于简化工艺和控制和降低因多次移种而引发染菌的可能性。但是于此同时我们也要尽量缩短由于种子发芽、生长而占用的非生产时间，延长发酵罐生产产物的时间，以提高发酵罐的生产率。改进发酵工艺也可减少种子罐级数l 孢子质量的影响因素：培养基原材料质量波动：起主要作用的是其中的无机离子含量不同。（产地、加工方法等的不同）水质的影响：（地区、季节、水体污染的不同）培养条件温度：对多数品种斜面孢子质量有显著影响湿度、通气量培养时间和冷藏时间衰老孢子不如年轻孢子。培养时间控制在孢子量多、孢子成熟、发酵产量正常的阶段终止培养冷藏：对孢子质量的影响与孢子成熟程度有关；对孢子生产能力也有影响接种量接种量移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例接种量大小影响到培养基中孢子的数量，进而影响菌体的生理状况l 影响种子质量的因素及其控制孢子的质量培养基营养成分适合种子培养的需要（适合孢子发芽、菌体生长）营养成分要尽可能与发酵培养基相近培养条件温度、通气量种龄 种龄种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。 通常，种龄以菌体处于生命力极为旺盛的对数期，且培养液中菌体量还未达到最高峰时，较为合适。过年轻的种子，接入发酵罐后，生长缓慢，产物合成期推迟，发酵周期延长；过老的种子，接入发酵罐后，生产能力下降，菌体过早自溶。 不同品种或者同一品种工艺条件不同，其最佳种龄也不一样，通常要通过试验来确定接种量 接种量的大小取决于生产菌种在发酵中生长繁殖的速度 不少商家通过加大接种量来缩短发酵罐中菌体繁殖到达高峰的时间，并采用丰富的培养基，使产物的形成提前到。有的产品采用两个种子罐接一个发酵罐的双种法。 但接种量过大，菌体生长过快、培养液黏度增加，造成溶氧不足，会影响产物的合成。 l 种子质量的控制措施1、菌种稳定性的检查 2、无杂菌检查（镜检、平板培养、生化分析） 3、接种技术（压差法、火焰封口法）从种子罐到发酵罐的接种，是通过接种管道，在压力作用下进行的。l 种子质量的标准: 生化指标细胞或菌体产物生成量酶活力l 种子异常分析：菌种生长发育缓慢或过快；菌丝结团、菌丝粘壁第三章 工业微生物的代谢调节和代谢工程一、微生物的代谢与代谢调节l 代谢：细胞一切生化反应的总称l 微生物代谢调节方式： 细胞透性调节限制基质与酶接近控制代谢流（调节酶量和酶活力）二、初级代谢及代谢调节l 初级代谢（ primary metabolism ）： 微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动所必需的物质和能量的过程。l 初级代谢产物合成中的主要调节方式： 酶活性调节：酶活性的激活酶活性的抑制反馈抑制：某代谢途径的终产物过量合成时反过来直接抑制该途径中第1个酶的活性，使整个反应过程减慢或停止，避免终产物过度积累。 酶活性调节的分子机制（方式）共价修饰：蛋白质分子中的一个或多个氨基酸残基与一化学基团共价连接或解开，使其活性改变的作用。可逆共价修饰：有些酶存在活性和非活性两种状态，它们可以通过另一种酶的催化作共价修饰而互相转换。（例子：磷酸化与去磷酸化；腺苷化与去腺苷化）不可逆共价修饰：酶原激活（胰酶原在肠肽酶的作用下从N端切除肽段，成为有活性的胰酶，胰酶能够自我催化，因此此过程只需要少许肠肽酶）变构效应： 一种小分子物质与一种蛋白质分子发生可逆的相互作用，导致这种蛋白质的构象发生改变，从而改变这种蛋白质与第三种分子的相互作用。具有变构效应的酶称变构酶，变构酶具有一个催化位点和一个调节位点（结合不同的效应物，引起不同的效应）缔合与解离: 能进行这种转变的蛋白质由多个亚基组成；蛋白质活化与钝化是通过亚基缔合与解离实现竞争性抑制： 分支代谢途径的反馈抑制协同抑制：分支途径的几种末端产物同时过量时才抑制共同途径中的第一个酶的活性。累积反馈抑制：分支途径的每种末端产物可以一定百分率单独抑制共同途径中的第一个酶的活性。各种产物间既无协同效应，又无拮抗作用，他们抑制的酶，有的是同功酶，有的是多功能酶。增效反馈抑制：代谢途径中任何一种末端产物过量时，仅部分抑制共同反应途径中的第一个酶活性，但是两个末端产物同时过量时，其抑制作用可超过各产物存在的抑制能力的总和。顺序反馈抑制：分支代谢途径中几个末端产物抑制分支点后的第一个酶的活性，导致分支点产物累积，进而反馈抑制共同途径中的第一个酶的活性，最后使整个代谢途径终止。名词解释：同工酶：能够催化同一生化反应，但酶结构有所不同的一组酶多功能酶：结构上仅为一种多肽，但是却具有两种或两种以上的催化活力的酶 酶合成调节 酶合成的诱导：名词解释：（1）组成酶：不依赖于酶底物或类似物的存在而合成。如葡萄糖转化为丙酮酸过程中的各种酶。 （2）诱导酶：依赖于某种底物或底物的结构类似物的存在而合成。如大肠杆菌乳糖利用酶。同时诱导：当诱导物加入后，同时或几乎同时诱导几种酶的合成；主要存在于短的代谢途径中。顺序诱导：先合成能分解底物的酶，再依次合成分解各中间代谢物的酶，以达到对较复杂代谢途径的分段调节。酶合成的阻遏（1）末端产物阻遏 (end-product repression)：由某代谢途径末端产物过量积累而引起的阻遏。 A、对直链途径：末端产物过量时阻遏该途径所有关键酶的合成。B、对分支途径：每种末端产物仅专一地阻遏合成它的那条分支途径的酶。代谢途径分支点以前的“公共酶”仅受所有分支途径末端产物的阻遏（多价阻遏作用）。（2）分解代谢物阻遏 (catabolite repression): 两种分解底物存在时,细胞利用快的那种底物阻遏利用慢的底物有关分解酶合成的现象 A、注意: 阻遏作用并非快速利用的碳源（或氮源）本身作用的结果；而是其分解代谢过程中所产生的中间代谢物引起；B、葡萄糖效应：这种抑制青霉素合成及乳糖利用的现象，起初认为只有葡萄糖才会产生，故称为葡萄糖效应。 C、分解代谢阻遏涉及到的是一些诱导酶 酶合成调节的分子机制目前，由Monod和Jacob提出的操纵子假说能较好地解释酶合成的诱导和阻遏操纵子： 启动子、操纵基因、结构基因调节基因：编码阻遏物或阻遏物蛋白（1）酶的诱导机制：(以E.coli乳糖操纵子为例)（2）末端产物(反馈)阻遏机制: (以色氨酸操纵子为例)（3）分解代谢阻遏机制: （以葡萄糖分解代谢物对乳糖分解酶的阻遏为例） 能荷调节： 能荷细胞ATP、ADP、AMP系统中可供利用的高能磷酸键的量度。能荷调节细胞通过ATP、ADP、AMP三者比例来调节其代谢活动。 细胞中全部为ATP时，能荷为100%；全部为AMP时，能荷为0；全部为ADP时，能荷为50%能荷不仅调节形成ATP的分解代谢酶类的活性，也调节利用ATP的生物合成酶类l 初级代谢调控 克服反馈调节的调控着手点方法降低末端产物浓度1） 营养缺陷型的利用2） 渗漏缺陷型的利用3） 提高细胞渗透性利用营养缺陷型积累直链代谢途径中间代谢产物；利用营养缺陷型积累分支代谢途径中的中间产物；利用营养缺陷型积累分支代谢途径末端产物应用抗反馈突变株1）调节基因突变2）操纵基因突变阻遏物蛋白不再与末端产物结合，解除阻遏活性阻遏物不能再与发生了突变的操纵基因结合名词解释： 营养缺陷型 是指原菌株因基因突变致使合成途径中断，丧失了合成某种必需物质的能力，而必须在培养基中加入相应物质才能正常生长的突变菌株渗漏缺陷型 是一种特殊的营养缺陷型，是遗传性代谢障碍不完全的突变型。其特点是酶活力下降而不完全丧失，并能在基本培养基上少量生长。获得方法：把大量营养缺陷型菌株接种在基本培养基平板上，挑选生长特别慢而菌落小提高细胞透性的方法：生物素：阻断脂肪酸的合成，影响细胞膜的合成表面活性剂：阻断脂肪酸的合成，影响细胞膜的合成在对数生长期添加青霉：抑制细胞壁合成 ，细胞膜损伤甘油缺陷性：磷脂合成受阻，影响细胞膜的合成油酸缺陷性：阻断不饱和脂肪酸的合成，影响细胞膜的合成抗反馈调节突变株 是一种解除合成代谢反馈调节机制的突变型菌株。其特点是所需产物不断积累，不会因其浓度超量而终止生产。 获得方法：1）通常可以用添加末端产物类似物的方法来筛选获得。 2）从营养缺陷型回复突变株中也可获得（对反馈不敏感） 克服分解代谢阻遏的调控1、避免使用有阻遏作用的碳源和氮源 2、流加碳源或氮源3、利用抗分解代谢阻遏的突变体（筛选方法：在以酶受阻遏的底物为唯一氮源的培养基上，选择能正常生长的菌落） 对诱导调节的控制A、为提高诱导酶的产量，对诱导调节控制的常用手段有：1、添加诱导物类似物2、添加辅酶或辅助因子 3、利用组成型突变株B、组成型突变株的筛选：原则：创造一种利于组成型菌株生长而不利于诱导型菌株生长的培养条件，造成对组成型的选择优势以及适当的识别两类菌落的方法，从而把组成型突变株选择出来。 诱导型菌株经诱变处理后，先在含乳糖的培养基中培养，由于组成型突变株半乳糖苷酶的合成不需诱导即能产生，因此可较诱导型的出发菌株较早开始生长，在一定时间内菌数的增加便较快。之后由于诱导酶形成后，原菌株生长速率亦逐渐增加，这种选择性造成的差别就会减少。可用交替在乳糖、葡萄糖培养基中进行培养的方法。在平板上识别组成型突变株的方法，主要是利用在无诱导物存在时进行培养，它能产生酶，加入适当的底物（通常使用酶解后可以有颜色变化的底物）进行反应显示酶活以识别三、次级代谢及次级代谢调节l 微生物的次级代谢次级代谢（ secondary metabolism）：某些生物为了避免在初级代谢过程中某种中间产物积累所造成不利作用或外环境因素胁迫而产生的一类有利于生存的代谢类型。次级代谢产物：微生物生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂、对该微生物无明显生理功能，或并非是微生物生长和繁殖所必需的物质。抗生素，生物碱，生长刺激素，毒素，色素，维生素l 微生物合成次级代谢产物的基本特征1）次级代谢产物一般在菌体生长后期合成 2）次级代谢产物合成时常伴随菌体形态或生理学的变化3）次级代谢产物具有种特异性 4）次级代谢产物酶的专一性低 5）次级代谢产物的合成受多基因控制6）次级代谢产物不少是结构相似的混合物l 分批发酵时，产生菌生长周期分为三个时期：菌体生长期、产物合成期、菌体自溶期l 产生菌能同时合成多种结构相似的次级代谢产物，原因是：1）合成次级代谢产物的酶系的特异性不强 ； 2）产生菌初合成的次级产物进行多种化学修饰而同时合成多种衍生物；3）一种次级代谢产物可由两种或两种以上的代谢途径合成。l 次级代谢产物的生物合成过程：l 次级代谢产物生物合成中的主要调控机制调控方式描述诱导调节磷酸盐调节磷酸盐能促进初级代谢，抑制菌体的次级代谢；过量磷酸盐抑制次级代谢产物前体的生物合成磷酸盐阻抑次级代谢中的磷酸酯酶碳分解产物调节l 能迅速被利用的碳源(葡萄糖)或其分解代谢产物，对其他代谢中的酶(包括分解酶和合成酶)的调节。分为分解产物阻遏和抑制两种。l 次级代谢产物的合成速率与产生菌的生长速率呈相反关系，所以凡能促进产生菌生长速度的碳源，对次级代谢产物生物合成都表现出抑制作用。氮分解产物调节在初级代谢中，氮分解代谢产物调节，即被迅速利用的氮源(氨)抑制作用于含底物的酶的合成。在次级代谢中，其阻遏作用也确实存在。生长速率调节在生长期次级代谢产物合成酶受到阻抑作用，次级代谢产物不能合成。调节次级代谢产物生物合成的因子是菌体的比生长速率，而不是某种营养物质。四、微生物代谢工程及应用代谢工程(Metabolic Engineering) 利用生物学原理，系统分析细胞代谢网络，并通过DNA重组技术合理设计细胞代谢途径及遗传修饰，进而完成细胞特性改造的应用性学科。l 代谢工程的实质: 在于对代谢流量及代谢控制进行定量分析，在此基础上进行代谢改造，最大限度地提高目的代谢产物的产率。l 代谢工程的目的在于构建具有新的代谢途径，能生产特定目的产物或具有过量生产能力的工程菌应用于工业生产。l 代谢工程的基本过程(1) 靶点设计：代谢流分析MFA-代谢流控制分析MCA-确定合理靶点(2) 基因操作：利用代谢工程改造细胞代谢网络核心是在分子水平上对靶基因或基因簇进行遗传 操作。如基因或基因簇的克隆、表达、修饰、敲除、调控以及重组基因在目标细胞染色体DNA上的稳定整合。(3) 效果分析: 一次性的代谢工程设计和操作往往不能达到实际生产所要求。初步构建的细胞可以作为新一轮实验的改造目标l 代谢工程的基本原理改变代谢途径扩展代谢途径构建新的代谢途径l 代谢工程的研究方法l 代谢工程的应用：第四章 培养基的设计与灭菌第一节 工业微生物培养基的成分1. 目前正在开发利用的碳源有：（1）纤维素（2）木质素（3）烃类（包括甲烷）2. 常用的碳源：糖类：如蔗糖、红糖或褐糖、糖蜜等。麦芽汁（大麦小麦等糖化所得）。淀粉（甘薯淀粉、玉米淀粉、大米淀粉等）。脂肪（油脂）；有机酸、醇（甲醇、乙醇等）。碳氢化合物3. 常用的氮源：玉米浆、大豆饼、鱼粉、棉籽饼粉、酵母浸出物、蛋白质水解物、发酵残液4. 生长因子：微生物生长不可或缺的微量有机物。维生素、氨基酸、嘌呤嘧啶及其衍生物。并不是对所有微生物都是必须的，只是对于不能合成生长因子的微生物为必须5. 提供生长因子的材料：玉米浆、麸皮水解物、糖蜜、酵母、其他（如动物心、肝脏）6. 前体：某些化合物加入到发酵培养基中，直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。最早在青霉素的生产中发现的。加入玉米浆后青霉素产量大大增大，是因为其中含有前体物质苯乙酸，它优先结合到产物分子中去7. 大多数前体，如苯乙酸对微生物的生长有毒性，以及菌体具有将前体氧化分解的能力，因此在生产中为了减少毒性和增加前体的利用率，常采用少量多次的流加工艺。8. 促进剂那些非细胞生长所必需的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。9. 促进剂提高产量原因是多方面的：（1）促进剂本身是酶的诱导物（2）促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性（3）有的可以沉淀或鳌合有害的金属离子。10. 抑制剂抑制某些代谢途径的进行，同时刺激另一代谢途径，以致可以改变微生物的代谢途径。第二节 工业微生物培养基的种类按培养基成分 分为合成培养基与天然培养基按物理性质分 固体、半固体、液体培养基按用途分 基础培养基、富集培养基、选择培养基、鉴别培养基 孢子培养基、种子培养基、发酵培养基孢子培养基用于繁殖孢子，固体培养基。营养不要太丰富，否则不易产孢子。控制无机盐浓、ph、湿度麸皮培养基、大小米培养基、玉米培养基种子培养基供孢子发芽、生长和菌体繁殖的培养基。营养要求丰富、完全，氮源和维生素的含量要高，但总浓度略稀薄为好，因高的溶解氧促进菌体生长和繁殖。有机氮源刺激孢子发芽，无机氮源促进菌体生长最后一级的种子培养基的成分最好能较接近于发酵培养基发酵培养基供菌体生长、繁殖和合成大量代谢产物用的培养基。除菌体生长必须元素和化合物外，还要有合成产物所需的特定元素、前体和促进剂等。第三节 工业微生物培养基的设计和优化培养基的设计原则（1）培养微生物的目标要明确：了解菌体的同化能力（2）培养基中的营养成分协调：快速碳（氮）源与慢速碳（氮）源的配合；合适的碳氮比；（3）培养基的理化条件要适宜：ph和其他理化性质（4）培养基的成本要尽可能地经济节约培养基设计的程序（大致步骤） 1）查阅文献；2）精心设计；3）实验确定及中试放大。第四节 工业微生物培养基的灭菌1. 湿热灭菌：蒸汽冷凝时释放大量潜热，并具有强大的穿透力，在高温和水存在时，微生物细胞中的蛋白质极易发生不可逆的凝固性变性，致使微生物在短时间内死亡。2. 湿热灭菌的方法：（1） 分批灭菌：又称实罐灭菌，将培养基置于发酵罐中，用蒸汽加热，达到预定灭菌温度后维持一段时间，再冷却到发酵温度，然后接种进行发酵的一种灭菌方式（2） 连续灭菌; 培养基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续的加热灭菌，冷却后送入已灭菌的发酵罐内的工艺过程。设备由连消塔、维持罐和冷却器组成。（3） 巴斯德消毒法：将消毒的液体食品置于60-80度下处理15s至30min，然后迅速冷却的方法.（4） 间歇灭菌法（丁达尔灭菌法）：在80100度蒸煮培养基1560min，在搁置室温下过夜，并重复以上过程三遍以上。3. 连续灭菌常用的有两种工艺流程：（1） 连消塔-喷淋冷却流程：培养基流入连消塔，通入蒸汽加热，当培养基流出连消塔时，已加热到所需的灭菌温度，然后在维持罐中维持一定时间，用喷淋装置冷却。（2） 板式换热器的灭菌流程：利用板式换热器，让冷的培养基与灭菌后的培养基进行热交换，从而提高热利用效率并减少冷却水用量的一种方法。4. 名词解释，空消、实消、连消5. 过滤除菌法直接用过滤器除去培养基中的微生物的方法。实验室常用的膜孔径是0.45微米和0.22微米。过滤器的种类有：绝对过滤器、深层过滤器6. 微波灭菌法第五节 空气除菌1. 空气除菌的方法:（1） 热杀法 利用空气压缩过程产生的热量进行灭菌的工艺流程。（2） 静电除菌利用静电引力来吸附带电粒子而达到除尘灭菌目的。（3） 过滤除菌使空气通过经高温灭菌的介质过滤层，将空气中的微生物等颗粒阻截在介质层中，而达到除菌的目的。2. 介质过滤除菌的机理（1） 捕集作用：介质过滤是以大孔隙的介质过滤层除去较小颗粒，这是一种滞留现象，而不是面积过滤。是由惯性冲击、拦截、扩散、重力沉降和静电吸附组成的（2） 惯性碰撞作用（3） 拦截作用（4） 布朗扩散作用（5） 重力沉降作用（6） 静电吸附作用3. 在介质过滤系统中由哪一种过滤机理起主导作用，由颗粒性质，介质性质和气流速度等决定。当气流速度小时，惯性碰幢作用不明显，以拦截和布朗运动现象为主，此时，除菌效率随气流速度增大而降低，当气流速度增大到某值时，除菌效率最小，此速度为临界速度。当气流速度继续增加，惯性碰幢代替拦截和布朗运动，除菌效率随着气流速度增加而提高。4. 空气过滤介质5. 空气过滤除菌的工艺流程高空取气管：远离地面几十米的管子。每升高10米，空气中杂菌可降低一个数量级，因此从高空取气要比从低空取气有利得多。 除尘器：又称空气粗滤器，主要是捕集较大的灰尘颗粒。防止这些东西进入压缩机而使气缸磨损。 空气压缩机; 克服过滤介质的阻力，管道、弯头的阻力和发酵液的液柱压力，同时，还要维持发酵罐正压，因此在生产中通过压缩机将空气压力提高。贮气罐：消除空压机排出空气量的脉动、持稳定的压力、分离部分油水冷却器：降低因空气压缩而产生的高热汽液分离器：分离空气中被冷凝成雾状的水雾和油雾.除雾器：通过油水分离器净化过的空气，仍含有粒度较小的杂质及油水雾滴，需在除雾器中进一步除去加热器：为了降低进入总过滤器的空气的相对湿度，使总过滤器保持干燥，需要在汽液分离器后加一个加热器。但温度不能加的太高，不然要引起总过滤器棉花的自燃，而失去过滤器效果。分过滤器：一般每个发酵罐和种子罐都各配有一个分空气过滤器。通常用平板式纤维纸过滤器第五章 微生物发酵过程原理第一节 微生物发酵动力学概述1. 微生物发酵动力学是研究各种发酵过程变量在活细胞的作用下变化的规律，以及各种发酵条件对这些变量变化速度的影响。2. 发酵动力学是以化学热力学(研究反应方向）和化学动力学（研究反应的速度）为基础，对发酵过程各种物质的变化进行描述。3. 发酵动力学研究的内容：细胞生长和死亡动力学、基质消耗动力学、氧消耗动力学、二氧化碳生成动力学、产物的合成和降解动力学、代谢热生成动力学4. 发酵动力学研究的对象：发酵过程中菌体生长、基质消耗、产物生成的动态平衡及其内在规律。5. 研究发酵动力学的方法：（1） 宏观处理法：将细胞看成是一种均匀分布的物质，建立非结构动力学模型。a) 概率论模型：着眼于微生物个体。须考虑每个细胞的差异来说明某一特定现象，或用以说明平均值附近的波动情况。b) 决定论模型：着眼于微生物群体。不考虑每个细胞的差异，而是取菌体性质及数量的平均值进行数学处理。（2） 质量平衡法： 6. 质量与能量平衡（1） 得率与维持因素：是衡量代谢效率高低的尺子，是衡量质量与能量平衡的基本参数。A. 维持因素: a) 维持活细胞群体在生长和死亡处于动态平衡状态和没有胞外代谢产物合成情况下的生命活动。如：细胞的运动，细胞物质的转运。b) 维持代谢用于维持的物质代谢。维持代谢没有物质的净合成，是完全用于产生能量的分解代谢。c) 维持因素ms单位质量干菌体在单位时间内因维持代谢消耗的基质量。d) 维持因素越低，菌株的能量代谢效率越高。B. 得率是指被消耗的物质和所合成产物之间量的关系。a) 生长得率指每消耗1g(或1mo1)基质所产生的菌体重(g). 基于基质消耗的实际得率；基于基质消耗的理论得率: 。注意：此时S是只与细胞生长有关的那部分基质消耗（不包括维持代谢和产物合成消耗）b) 产物得率指每消耗1g(或mo1)基质所合成的产物g数(或mol数)实际产物得率： 理论生产得率：c) 基于碳消耗的细胞得率 d) 基于能量消耗的细胞得率 e) 基于ATP的细胞得率 f) 产物生产速率 g) 产物比生产率(qP，g(或mo1)g菌体h)每克菌体在一小时内合成产物的量，表示细胞合成产物的速度或能力，可以作为判断微生物合成代谢产物的效率 h) 菌体生长速率i) 菌体比生长率(m)每克菌体在一小时内合成菌体的量，它表示细胞合成菌体的速度或能力。j) 基质消耗速率 k) 基质比消耗速率(Qs , g(或mo1)g菌体h)每克菌体在一小时内消耗营养物质的量。表示细胞对营养物质利用的速率或效率。 7. 微生物反应过程中的质量与能量平衡 （1） 碳平衡 ：基质中的碳菌体中的碳+产物中的碳+CO2中碳（2） 氮平衡 ：基质中的氮菌体中的氮+产物中的氮 （3） 基质平衡若发酵过程没有中间代谢产物积累，有：；在以生产细胞物质为目的的发酵过程中，代谢产物的积累可以忽略不计的情况下，则：（4） 氧平衡： 比耗氧率（呼吸强度）： 8. 碳平衡： CO2比生成率：9. 能量平衡：消耗的总化学能=分解代谢+菌体生长+产物合成10. 燃烧热 发酵中释放的分解代谢热（发酵热）11. 化学能平衡（右图）12. 氧平衡：呼吸需氧量第二节、 微生物生长与产物合成动力学1. 微生物生长动力学（右图monod方程）： Ks的大小表示微生物对基质亲和力的强弱， Ks越大，微生物对基质的亲和力越弱，这时菌体生长对基质浓度的变化较为不敏感。 当s Ks，基质浓度较高时，与s无关，零级反应。 当s趋近于无穷大时，=max。 Monod方程只适用于单一基质限制及不存在抑制性物质的情况，除了一种生长限制基质外，其它必需营养都是过量的，但这种过量又不致引起对生长的限制，在生长过程中也没有抑制性产物生成。 Monod方程参数的确定的方法：双倒数作图法以s对s/作图2. 细胞死亡动力学3. 产物合成动力学Luedeking和Piret模型：把产物生产率看作是菌体生长率和菌体量的函数。a) 生长偶联型b) 生长半偶联型c) 生长非偶联型第三节 微生物发酵动力学1、 发酵类型根据微生物对氧的需求好氧性发酵厌气性发酵按发酵培养基物理状态分固体发酵按物料堆厚薄分：薄层发酵厚层发酵优点：农副产品为原料，生产成本和能量消耗都较低；产物浓度高缺点：散热性能差、供氧差、杂菌污染液体发酵表面培养法附着培养法深层培养法发酵工业中的主要方式2、 发酵方式分批式操作补料分批式操作连续式操作第三节 微生物代谢的方式补料分批式操作连续式操作概念特点缺点分批式操作(反复分批发酵)向反应器中一次投入所需的培养基，然后接种培养，反应结束后将全部培养液排出进行处理的操作方式。 微生物所处的环境不断变化； 可进行少量多品种发酵生产； 杂菌污染易终止操作； 运转条件发生变化或需要生产新产品时，易改变处理对策； 原料要求较粗放。 效率低； 不控制培养基组分浓度等环境因素，而任其自然变化，这样不利于生产。 主发酵之前须进行几级种子培养。补料分批式操作在进行分批培养的时候，随着营养的消耗，向反应器内补充一种或多种营养物质，以达到延长生产期和控制发酵过程的目的。 可解除底物的抑制、产物反馈抑制，葡萄糖分解阻遏效应 避免在分批发酵中因一次性投糖过多造成细胞大量生长，耗氧过多，以至通风搅拌设备不能匹配的状况。 菌体可被控制在一系列连续的过渡态阶段，可用来作为控制细胞质量的手段。 与连续发酵相比无菌要求低；菌种变异，退化少；适用范围更广。连续式操作在培养的过程中，不断向反应器内流加培养基，同时以相同的流量从反应器中取出培养液，使反应条件不随时间变化而变化的操作方式。补料方式：1、间歇添加法：间