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基因工程实验 培训指南西南大学生命科学学院生物工程与生物技术教研室2014年6月PCR检测目的基因一、 实验目的与原理简介学习PCR法体外扩增DNA的原理及操作方法；了解扩增过程中各因素对扩增结果的影响；掌握引物设计的原则和方法，通过PCR扩增检测目的基因是否成功导入受体细胞。聚合酶链式反应Polymerase Chain Reaction（PCR），即通过引物延伸核酸的某一区域而进行的重复双向DNA合成。1985年，K.Mullis等研究成功的一种在体外快速扩增特定基因DNA序列的方法，也因此而获得了若贝尔奖。PCR的原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸。多次重复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。由于PCR在分子克隆和DNA分析中具有许多广泛的用途，特别是近年来迅速出现了许多以PCR为基础的新技术，因此，学习并尽快掌握这一门常规技术是十分必要的。影响PCR反应的因素主要在于两个方面：1）引物的合理设计；2）PCR反应体系及反应条件的优化。二、 仪器及药品PCR扩增仪，PCR用薄壁管，移液枪及电泳仪等；Taq DNA聚合酶，10PCR buffer，25mmol/lMgcl2，0.25mmol/ldNTP， 10umol/l引物，模板DNA分子（0.1-2ug/ul）三、 实验步骤（一）检测目的基因甘薯ADK基因是否成功导入农杆菌(LBA4404)-用于植物基因工程1）用PCR薄壁管，在50 ul反应体系中分别加入：MiniQ H2O 37.5ul10PCR buffer 5ul25mM MgCl2 3ul10mM dNTP mix 1ul引物F(10M) 1ul引物R(10M) 1ulTaq(2 to 5 units/ul) 0.5ul模板（菌液） 1ul终体积为 50 ul 注意：如果只是普通的检测，而无须回收时，则25ul的反应体系即可（上述体系中的各成分相应减半）2）短暂离心混匀后，放入PCR仪中，反应程序如下：I） 94 8min（时间根据模板来确定） II） 94 40S 变性60 40S（退火温度和时间根据引物来确定） 退火 72 1min（时间根据扩增片段长度来确定） 延伸30-35个循环 （循环次数根据扩增目的来确定） III） 72 7-10minIV） 4 保存(一般不保存，保存对PCR仪损坏大)3）反应完成后，将PCR产物用1琼脂糖凝胶电泳进行检测，并拍照记录实验结果（二）检测目的基因甘薯GGPPS基因是否成功导入工程菌-用于微生物基因工程1）用PCR薄壁管，在50 ul反应体系中分别加入：MiniQ H2O 37.5ul10PCR buffer 5ul25mM MgCl2 3ul10mM dNTP mix 1ul引物F(10M) 1ul引物R(10M) 1ulTaq(2 to 5 units/ul) 0.5ul模板 （菌液） 1ul终体积为 50 ul 2）短暂离心混匀后，放入PCR仪中，反应程序如下：I） 94 8min（时间根据模板来确定）II） 94 40S62.540S（退火温度和时间根据引物来确定） 72 1min（时间根据扩增片段长度来确定） 30-35个循环 （循环次数根据扩增目的来确定） III） 72 7-10minIV） 4 保存(一般不保存，保存对PCR仪损坏大)3）反应完成后，将PCR产物用1琼脂糖凝胶电泳进行检测，并拍照记录实验结果四、 注意事项1） 实验必须严格操作，杜绝所有可能的DNA痕量污染，并同时设置阴性参照（即同样的反应体系和条件下不加模板而进行PCR，来检测反应体系是否被污染）；2） PCR反应对于不同的模板及引物而条件不同，具体扩增的反应条件需要通过实验来摸索和优化，从而建立最佳条件；3） 推荐采用热启动策略（即等模板94充分解链后，一般94保持3min即可，再加入酶以减少非特异扩增现象的发生）来提高反应的特异性；4） Taq酶永远最后加入反应体系，酶极易失活，应该在冰盒上操作，用完及时放回冰箱中；5） PCR中尽可能使用高质量的水如MiniQ H2O；6） 引物浓度不宜过高（我们一般的使用浓度为10M），否则易形成引物二聚体，同时还可能会导致非特异性产物的扩增；7） 新合成的引物，回来后稍加离心后，可用MiniQ H2O配成高浓度的母液，并取部分配成10M的工作液。 附：PCR引物的设计原则PCR引物的设计是否合理，是决定PCR体外扩增能否成功的关键因素之一。因此，进行PCR引物的设计时需要注意以下几个方面的问题：1.引物的长度引物的长度一般设计在15-30个核苷酸之间比较合适。引物过短时会造成Tm值过低，在酶反应温度时不能与模板很好的配对；引物过长时又会造成Tm值过高，超过酶的最适反应温度。同时合成长引物还会使合成费用大大增加，所以没有必要设计过长的引物。我们实验中通常设计的引物长度在21碱基左右。2.引物的GC%含量尽可能的将引物的GC%含量设计在40-60%的范围内，因为GC比过高与过低都会直接造成Tm值的过高与过低。Tm值的估计可简单地根据经验公式Tm=4GC+2AT+3.3而最适退火温度Taopt(optimal annealing temperature)= Tm-53.引物的3端起始碱基椐研究报导，Taq在3末端错配时延伸效率是不一样的，此时的延伸效率为TG=CA。也即当引物的3末端为A是，即使有错配碱基也最不易延伸，所以引物的设计可考虑3末端为A，用以提高复制的精确性。不过，也有研究报道认为3末端应该设计为G或C，这是因为G与C的氢键多于A与T，能更好的与模板结合并开始DNA的合成，当然对错配延伸效率方面就不能苛求了。总之，无论那种情况下，引物的3末端尽量不要考虑使用T。4.引物无回文对称结构（亦称发夹结构）引物自身应无回文对称结构，否则会形成茎环结构。据报道，形成茎环的环在5-7个核苷酸以上时结构非常稳定，茎越长越稳定。茎环的生成与否还会与引物的Tm值有关，引物的Tm值越高时也越能容忍此类结构，因为在相当高的温度下茎环结构会自行打开。尽管如此，设计中仍要尽量避免此类结构。5.引物自身不能配对 5-TCGA-33-AGCT-5即引物自身之间不能有配对的多个碱基，特别是在引物的3端。例如，一引物的3末端碱基为5-TCGA3，那么另一同样的引物会与之形的结构，从而扩增形成引物二聚体。6两个引物的Tm值设计时注意尽可能使两个引物的Tm值相近，不然两个引物必然不能同时达到最佳退火温度，将会影响PCR扩增的效果。7两个引物之间不能配对如果两个引物之间能配对的话，就会生成引物二聚体，而影响扩增效率。以上是PCR引物设计的基本原则，设计时特别要注意引物的3末端与模板DNA的精确配对，否则易造成非特异扩增。我们只要综合考虑以上原则，应该可以设计出参数比较合理的引物，相信通过一定的实际操作来锻炼一下，引物的设计应该不是一件难事！例：甘薯GGPP合成酶（IbcrtE）基因全长序列：ataaaagaaatgttaggtctccactcttccaattccaagtgacgtctgttgaatgctctgagagttctcaaaagaaatctccgaactgcattttcattcacagaggggaaagaatcaaagaATGAGTCTTGCAAATCCTAGCACAACTTGGGCAAAGACCCATTCTTTTTGCGGCAGATTCAGATCCGGGTCTCTCATAAAAAGCAATGAATTCCGCATAAATCTCTCGTTCCCGAGCTCAATCAGGAAAAAACCGGTGTTTCATTCTTGCTCCGCGATTCTCACCAAGGAGCAGACCGATGTTCCCCAGGGAGAAAGCGAGAACAAGCTTGATTTCAAGGCGTACGTGTTGGGGAAGGCGGAATCGGTGAACAAGGCGCTGGAAGCGGCGGTGTTGCTGAAGGAGCCGTTGAGGGTTCACGAATCGATGAGGTACTCTCTCCTCGCCGGCGGGAAGAGGATCCGGCCAATGCTATGTATCGCCGCCTGCGAGCTGGTCGGCGGGGATGATGCCACCGCCATGCCGGCGGCCTGCGCGGTGGAGATGATTCACACCATGTCTCTGATGCACGACGACCTCCCGTGTATGGACAACGACGATTTGCGGCGAGGGAAGCCGACGAACCACAAGGTTTTCGGGGAAAACGTGGCGGTTCTCGCCGGGGATGCGTTGTTGTCATTCGCCTTTGAGCATATAGCCACCGCCACAAAAGGGGTTTCCTCGGAGAAGATAGTGAGGGTAATTGGGGAATTGGCTAAGTGCATTGGGGCTGAGGGGCTCGTGGCTGGGCAGGTAGTGGATATATGCTCAGAGGGGATCTCCGATGTGGGATTAGAACATTTGGAGTTCATTCATCTCCACAAAACCGCAGCTTTGCTGGAGGCTTCTGTGGTTCTGGGAGCGGTTCTGGGTGGGGGAACTGAGGAAGAGGTTGCTAAATTAAGGAAATTCGCCCGAAACATCGGGCTGTTGTTTCAGGTTGTTGATGACATTCTTGATGTCACCAAATCCTCCCATGAATTGGGGAAGACAGCTGGGAAGGATTTGGTTGCTGACAAGGTAACTTATCCTAAGCTGCTTGGGCTTCAGAAGTCCAGAGAGTTTGCTGAGCAGCTGAACAAAGAGGCTCAGGCTCAGCTCTCTGGCTTTGATCAAGGCAAGGCTGCCCCGTTGATCGCCTTGGCCAATTACATTGCTTACCGGGAGAACTGATGAttcctagtgagtgactcgattcttgtactagaacaagtgaacaactgccatttgatatatgatgatgcctctctcttgtgcattacaaaatcgatagagttagtcttaaga