北师大版选修1 4.3 聚合酶链式反应技术 课件（30张）.pptx

第4章现代生物技术 第3节聚合酶链式反应技术 学习目标 掌握pcr反应原理学习引物序列的设计学习pcr反应体系的设计学习pcr反应程序参数的设计学习通过聚合酶链式反应 pcr 在体外大量扩增位于两段已知序列间的dna区段 实验原理 1 聚合酶链式反应技术简介2 基本原理及特点3 一个典型pcr的反应体系及程序参数介绍4 dna聚合酶5 寡核苷酸引物的设计 1 聚合酶链式反应技术简介 多聚酶链式反应 polymerasechainreaction 简称pcr技术 是1983年 美国科学家k b mullis发明的一种体外快速扩增特定基因或dna序列的方法 pcr技术已迅速渗透到分子生物学的各个领域 引起了生物技术发展的一次革命 目前它在分子克隆 目的基因检测 遗传病的基因诊断 法医学 考古学等方面得到了广泛的应用 2 pcr技术基本原理及特点 pcr技术实际上是在模板dna 引物和 种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于dna聚合酶的酶促合反应 大量扩增位于两段已知序列间的dna区段 反应主要涉及三个反应的循环 高温变性 denaturation 发生链的分离 低温退火 annealing 发生引物杂交 适温延伸 extension 发生dna合成 pcr反应循环示意图 双链dna分离出2条单链dna分子 一对特异性引物分别结合到两条单链模板dna上 在dna聚合酶的作用下 dntps从引物3 端开始参入 并沿着模板从5 向3 方向延伸 合成出新生的dna互补链 94 高温变性 53 低温退火 上游引物 下游引物 72 适温延伸 1个分子 2n个分子 n个循环 3 一个典型反应的反应体系及程序参数介绍 反应体系 反应物终浓度10 buffer2 l4 dntps 1mm 800 mol lmgcl2 25mm 1 5mmol ldna聚合酶1u上游引物p1400pmol l下游引物p2400pmol l模板 20ng 补水至总体积20 l 3 一个典型反应的反应体系及程序参数介绍 1 pcr缓冲液含50mmol lkcl及tris hcl ph8 3 2 mgcl2二价阳离子对于酶活性是必须的 mg2 优于mn2 而ca2 无效 mg2 的最佳浓度相当低 一般1 5mmol l 且模板dna中的edta及dntps中的负电离子基团 磷酸根等都会影响到mg2 的有效浓度 在开始新的pcr组合时 可在0 05mmol l 5mmol l之间 设0 5mmol l的梯度 进行pcr 来摸索最佳mg2 浓度 mg2 浓度对pcr扩增反应的特异性和产量有着显著影响 浓度过高可降低pcr扩增的特异性 浓度过低则影响pcr扩增产量甚至使pcr扩增失败而不出扩增条带 3 dntps 四种脱氧核糖核苷三磷酸 每种dntp的终浓度为50 200 mol l 一般在饱和浓度下使用 即每种200 mol l 4 模板dna闭环靶序列dna的扩增效率略低于线状dna 对哺乳动物基因组dna扩增 每次反应约需1 0 1 g 对于细菌或质粒dna 仅为pg 10 12g 到ng 10 9g 还可以直接以细胞为模板 4 dna聚合酶 1 taq酶taqdna聚合酶是于1986年从一种生活在75 热泉中的栖热水生菌中分离纯化出来 具有3个重要的特性 耐高温最适温度是72 连续保温30min 仍具有相当的活性 且在比较宽的温度范围内都保持着催化dna合成的能力 具有腺嘌呤脱氧核苷三磷酸末端转移酶活性使扩增的dna的3 端多带上一个 a 有利于进行ta克隆 在体外 失去3 5 方向外切酶校正活性 有参错情况出现 在一次典型的pcr反应中 其参错率约为1 2 104核苷酸 在体内是1 109核苷酸 2 高保真酶但没有腺嘌呤脱氧核苷三磷酸末端转移酶活性 引物需要设计限制性酶切位点 以便后续的克隆 3 酶量控制根据片段长短 循环数多少 并非越多越好 加酶过多 会导致非靶序列扩增 在其他参数最佳时 每100 l反应液中含1 2 5utaqdna酶 酶浓度太高 会出现非特异性扩增 而过低时 则扩增产量太低 5 寡核苷酸引物的设计 引物 引物 3 5 5 5 基因组 引物的序列及其与模板结合的特异性是决定pcr反应结果的关键 引物设计的主要原则是最大限度地提高扩增效率和特异性 同时尽可能减少非特异性扩增 引物设计关键点 与模板的互补及错配情况 应有效结合到目的序列上 尽可能不与其他部位结合 且两引物的结合位点之间一般为1 2kb 超过3kb扩增效率大大降低 3 端要求完全互补 尤其3 端最后5 6个核苷酸的错配应尽可能的少 一般5 端可以添加一些限制性酶切位点及其保护碱基 不会影响引物特异序列的退火 引物长度 一般为20 30个碱基长 最低不能少于16个 引物太短很可能会同非靶序列杂交 得到非预期的扩增产物 一般每增加一个核苷酸 引物特异性提高4倍 但不能太长 太长增加成本 且引物同模板dna的杂交速率下降 影响pcr反应效率 引物序列 尽量使其gc含量为50 左右 避免出现多个嘌呤或嘧啶 以防止形成二级结构 避免出现连续4个以上同一个碱基 3 端应选用at 少用gc 可提高引发效率 避免假引发 引物二聚体 特别要注意引物之间不能互补 尤其在3 末端 否则 就会发生退火 出现引物二聚体的扩增 与天然模板之间产生竞争的pcr状态 从而影响扩增成功 若一个反应中加入多对引物 应将其进行交叉配对检验 若仍有二聚体出现 则改变mg2 浓度 可降低其含量 引物tm值 15 25nt时 tm 4 g c 2 a t 大于25nt 则要考虑热动力学参数 可用软件计算 两条引物的tm应尽可能相等或相近 最好相差不超过3 退火温度决定于tm值 它影响引物与模板的结合效率 引物容易结合到模板上的温度是tm减15 25 但退火温度太低会导致特异性丧失 在tm值允许的范围内 选择较高的温度 可大大减少引物和模板之间的非特异性结合 从而提高pcr的特异性 所以为了兼顾引物结合效率和扩增特异性 人们采用的退火温度为tm减5 15 引物浓度 通常1 mol l足以完成30个循环 浓度过高会导致非特异性扩增或引物二聚体扩增 浓度不足则会降低pcr效率 实验材料 l 仪器和材料pcr扩增仪 台式高速离心机 ep管 0 2ml 微量取液器 20 l和200 l吸头2 试剂 1 taqdna聚合酶 5u l 2 dntps混合液 3 引物dna 4 模板dna 含有1500bp目标基因的质粒 3 实验步骤 1 pcr反应扩增目标片段 1 pcr循环仪预热 2 按以下反应体系 将各成分在一个灭菌的0 2mlep管内混合 反应体系 反应物终浓度所加体积10 buffer2 l2 l4 dntp 1mm 800 m2 lmgcl2 25mm 1 25mmol ldna聚合酶1u0 2 l上游引物p1400pmol l1 l下游引物p2400pmol l1 l模板 20ng 0 3 l补水至总体积20 l20 l 用手指在管壁上轻弹几下 混匀上述反应混合物 高速离心机离心10s 使反应液集中在管底 3 待pcr仪预热后 将上述反应混合液放于pcr仪的小池中 4 按以下程序输入扩增仪 进行pcr扩增 2 扩增产物的电泳检测 1 用tbe配置1 的琼脂糖凝胶 2 每人以自提质粒为模板 各做20ulpcr体系 反应结束后 在pcr反应小管中加入2 5 l10 loadingbuffer 混匀 取3 5ul小孔上样检测 剩下的量两人合并大孔上样电泳 用于后续回收 70v 100v marker trans2kplus 3 紫外检测 预期结果 注意事项 1 注意pcr仪的使用 2 除特别指出外 加入反应成分及每一步骤间隙均需在冰上进行 防止微量液体被挥发及非特异反应 3 加入taqdna聚合酶后 要充分混匀体系 并用离心机轻甩一次 1 下列有关pcr技术的叙述 不正确的是 a pcr技术经过变形 复性 延伸三个阶段b pcr技术可用于基因诊断 判断亲缘关系等c pcr技术需在体内进行d pcr技术是利用碱基互补配对的原则 c 随堂练习 2 dna的复制需要引物 其主要原因是 a 可加快dna的复制速度b 引物可与dna母链碱基互补配对结合c 引物的5 端有助于dna聚合酶延伸dna链d dna聚合酶只能从3