生物技术制药课堂重点.doc

第一章绪论生物技术（biotechnology）：是指将生物用于有价值产品的生产。生物技术制药（biotechnology pharmaceutics）:用现代生物技术制造药物。是指利用基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程、蛋白质工程等生物技术，来研究、开发和生产用于预防、治疗、诊断疾病的药物。生物药物（biological drug）：从生物体中制取的各种天然活性物质及其人工合成或半合成的天然物质类似物。生物技术药物（biotechnological drug）:利用现代生物技术生产的蛋白质或核酸类等生物药物。现代生物技术的主要内容 基因工程技术 细胞工程技术 酶工程技术 发酵工程技术生物技术制药的主要内容 基因工程制药 细胞工程制药 酶工程制药 发酵工程制药基因工程技术：是将一种生物体的基因与载体在体外进行连接，然后转入另一种生物体内，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物。细胞工程技术：包括细胞及转基因细胞的离体培养、繁殖、再生、融合以及细胞核、细胞器（如线粒体、叶绿体等）的移植与改建等操作技术。酶工程技术：在一定生物反应装置中利用酶的催化作用，将相应的原料转化成有用物质的技术。发酵工程技术：培养活细胞以取得生物体或代谢产物的技术。（抗生素、氨基酸、维生素）生物制药：从生物材料中提取、分离、纯化药物的过程。第2章 基因工程制药基因工程制药：是指利用基因工程技术生产蛋白质或多肽类药物。基因工程药物制造步骤: 上游阶段：分离目的基因，构建工程菌，目的基因的表达。下游阶段：从工程菌的大量培养到产品的分离纯化和质量控制。分离纯化的步骤：细胞分离-细胞破碎-固液分离-浓缩与初步分离-高度纯化直至得到纯品-成品加工基因重组蛋白的主要分离技术： 分离、沉淀（等电点沉淀法、盐析法） 、膜分离、双水相萃取。基因重组蛋白的主要纯化技术: 1.离子交换层析 2.亲和层析 3.凝胶过滤层析(分子量大的先洗脱下来）4. 反相色谱和疏水色谱亲和层析的主要步骤： a.配体固定化 b.亲和吸附阶段 c.洗涤阶段 d.洗脱解离阶段 e.再生阶段凝胶过滤法的用途： 脱盐、分级分离、分子量的测定反相色谱和疏水色谱：根据蛋白质疏水性的差异来实现分离纯化的。基因工程药物的改造的目的：提高疗效降低毒副作用。基因定点突变技术（site-directed mutagenesis）:能够在基因水平上对所编码的蛋白质分子进行改造。融合蛋白：在人工条件下将两个或多个基因的编码区首尾连接, 由同一调控序列控制构成的基因表达后所得的蛋白质产物称为融合蛋白 (fusion protein,FP)。融合蛋白的作用：延长半衰期、降低清除率选择分离纯化方法的依据 1.据产物表达形式来选择 2.根据分离纯化单元之间的衔接选择 3.根据分离纯化工艺的要求来选择疏水层析和反相层析的区别:基因工程药物的修饰与改造： 1、构建突变体 2、融合蛋白基因工程药物的质量控制项目： 1、蛋白质的含量测定 2、蛋白质的纯度检测 3、蛋白质Mr测定 4、蛋白质等电点测定 5、蛋白质序列分析6、 内毒素分析、宿主蛋白与核酸残留分析蛋白质纯度的鉴定：电泳法、色谱法、质谱法、末端氨基酸残基分析法蛋白质分子量测定: SDSPAGE、凝胶色谱法、质谱法内毒素分析、宿主蛋白与核酸残留分析 a.内毒素分析：鲎试剂、家兔体温。 b.宿主蛋白：免疫分析试剂盒。 c.核酸残留：核酸杂交法、PCR 方法和高亲和力DNA结合蛋白。 第三章 动物细胞工程制药动物细胞生产药物的优缺点： 优点:有翻译后修饰，与天然产品一致;分泌胞外、纯化方便。缺点:培养条件高、成本高、产量低。体外培养动物细胞的类型： 贴壁依赖性细胞、贴壁非依赖性细胞（悬浮细胞）、兼性贴壁细胞*显著污染的标志是：培养基的pH值迅速改变，细胞外形模糊。动物细胞培养的环境条件：（无细胞壁，对环境条件非常敏感） 培养温度 pH值 通氧量 防止污染 基本营养物质 渗透压实验室动物细胞培养的基本技术： 细胞的原代培养 细胞的传代培养 细胞克隆培养 动物细胞的冻存与复苏 原代细胞（primary cell）：直接将动物组织或器官经过粉碎、消化而制得的悬浮细胞称为原代细胞。原代培养方法 ：组织块培养法、 单层细胞培养法。细胞传代(passage)：将细胞从一个培养器皿中消化、分散并接种至另一个培养器皿中的操作称为细胞传代。细胞克隆培养的方法： 有限稀释法，软琼脂平板克隆法。细胞的冻存：加保护剂如甘油、DMSO；缓慢降温。动物细胞冻存注意事项： 选对数生长期细胞； 冻存前一天要换液培养； 细胞密度1106 2 106个ml 冻存液加保护剂（DMSO、甘油） 冻存管封口后要检查其密封性；标签标注细胞名称，编号和冻存日期。 细胞复苏的注意事项：*细胞复苏的原则是快速融化 戴面罩和手套；37水浴中迅速融化；用乙醇擦拭冻存管的外壁；尽早将细胞离心或稀释； 隔天看细胞，再换液一次。动物细胞的营养要求：水、碳源、氮源、维生素、激素及无机盐等。动物细胞培养基的分类： 天然培养基； 合成培养基； 无血清培养基。动物细胞培养基的消毒 ： *不能采用高压法灭菌。 用膜过滤除菌、分装、储存。动物细胞培养常用的其他溶液： 1平衡盐溶液：由生理盐水和葡萄糖组成。 2培养基pH调整液 ：NaHCO3 溶液、HEPES 3细胞消化液：（1）胰蛋白酶溶液 （2）EDTA溶液 （非酶性解离）4抗生素溶液 细胞系（Cell Line）：原代培养物经首次传代成功即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系（Lineage of Cells）所组成。这种细胞世系由多种细胞组成。细胞株（Cell Strain）：通过选择法或克隆法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的细胞称为细胞株。生产用动物细胞的种类： 1原代细胞系 2传代细胞株 3转化细胞株 4工程细胞株转化细胞株：正常细胞经过某个转化过程，失去正常细胞的特点而获得无限增殖的能力，得到的细胞株。*CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞）：已成功应用于表达促红细胞生成素(EPO) 、重组乙肝疫苗等。（Chinese hamster ovary cell ）*SP2：小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞的融合细胞细胞库的建立： 原始细胞库（master cell bank , MCB) 生产用细胞库(manufacturers working cell bank , MWCB） （working cell bank）动物细胞的大规模培养:是指在人工条件下（设定温度、pH、溶氧等），在细胞生物反应器中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。动物细胞的大规模培养方法: 悬浮培养法 微载体培养法 多孔载体培养法 微囊化培养法 中空纤维培养法常用的动物细胞生物反应器 搅拌式生物反应器 气升式生物反应器 中空纤维式生物反应器 透析袋式或膜式生物反应器 固定床或流化床式生物反应器 一次性摇袋式细胞培养生物反应器动物细胞生物反应器的主要操作模式 : 分批操作 补料-分批操作 半连续操作 连续式操作 . 灌流式操作*工厂采用的操作模式主要是？ 工业上为了防止出现菌种衰退和杂菌污染等实际问题，大都采用分批操作或补料分批操作这两种方式。转基因动物制作方法：采用基因工程技术把外源目的基因导入动物生殖细胞、胚胎干细胞和早期胚胎，并在受体动物的染色体上稳定整合，再经过发育途径把外源目的基因稳定地传给子代，通过这项技术所获得的动物即为transgenic animal。 常用的转基因动物生物反应器： 乳腺、血液、尿液、鸡蛋 体细胞核移植技术 ： a.目的外源基因和标记基因的融合基因导入培养的体细胞中； b.筛选导入外源基因的体细胞； c.此体细胞的核移植到去核卵母细胞中。 体细胞核移植的优点: (1) 事先筛选转基因阳性细胞作为核供体, 极大提高阳性转基因动物生产率; (2) 培养的体细胞更易于进行基因打靶等基因操作;(3) 可以事先确定核移植后代的性别, 定向生产转基因动物。 第四章 抗体工程制药抗体工程制药：利用基因工程、细胞工程、发酵工程和转基因动、植物技术生产抗体药物的过程。人工制备抗体经历了三个阶段 第一代：多克隆抗血清 第二代：单克隆抗体(细胞工程抗体） 第三代：基因工程抗体抗原表位：epitope又称抗原决定簇（antigenic determinant，AD）指抗原分子中决定抗原性的特殊化学基团。抗体的结构抗体的功能： a. binding （V区的功能） b.Induce immune responses after binding （ C区的功能）V区的功能:特异性结合抗原（Recognize and bind antigen）： 1.中和作用（病毒、毒素） 2.阻止黏附 3.凝集细菌C区的功能:Induce immune responses after binding: 1.激活补体（complement dependent cytotoxicity，CDC） 2.结合Fc受体: a.调理作用 b.介导antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC c.介导I型超敏反应 3.穿越胎盘和黏膜单克隆抗体制备流程图 ：抗原的制备： 重组蛋白抗原 提取纯化的天然抗原 合成多肽半抗原 小分子半抗原 半抗原与载体偶联免疫方法： 体内、体外、脾内免疫法细胞准备： 1.饲养细胞（feeder cells） 2.骨髓瘤细胞 *选对数生长期，活细胞计数95 3.免疫脾细胞杂交瘤细胞的克隆化方法： 有限稀释法、软琼脂法单链抗体：是利用DNA重组技术将抗体一条VH和一条VL基因通过一短肽链（接头DNA, linker）连接后表达出来的抗体片断。人源化抗体：用鼠的互补决定区序列替换人的相应序列。也叫CDR移植抗体（CDR grafting antibody）或改型抗体。传统的鼠单抗在治疗应用方面有那些局限？鼠单抗被机体认为是外源蛋白质，在人体内引发严重的免疫反应。这种免疫反应不只中和了抗体的治疗作用，而且当机体再遇到此抗体时会发生严重的过敏反应。鼠抗体在应用中受到的第二个限制是其不能有效地激活效应物功能（ADCC和CDC），正是因为这一限制使其无法作为肿瘤治疗药物得以应用。什么是噬菌体抗体库？用体外基因克隆技术将B细胞全套可变区基因克隆出来，插入噬菌体表达载体，转化细菌进行表达，在噬菌体表面形成噬菌体抗体的群体，即为噬菌体抗体库（surface display antibody library）。采用什么方法可获得部分或全部人源的治疗用抗体？ 人血清来源 人杂交瘤单克隆抗体 鼠单抗人源化 噬菌体抗体库 转基因小鼠 重组人多克隆抗体技术 从人外周血高效筛选分泌特异性单抗的单个细胞操作法简述噬菌体抗体库技术的基本方法 扩增全套抗体可变区基因； 构建表达载体； 导入细胞、表达； 淘选（Panning)； 表达与鉴定。简述抗体库技术产生的三项技术基础 RT-PCR：能够克隆全套抗体可变区基因； 表达技术：抗体基因片段在大肠杆菌中的成功表达； 噬菌体表面展示技术（phage display) 。噬菌体抗体库技术？是丝状噬菌体展示技术与抗体组合文库技术相结合而产生的技术。单克隆抗体药物的分类 抗体或抗体片段（裸抗体）：完整的抗体包括嵌合抗体、人源化抗体和人抗体，抗体片段包括Fab，F(ab)2，ScFv等。 抗体偶联物或称免疫偶联物：由抗体或抗体片段与“弹头”物质连接而成，可用作“弹头”的物质有放射性核素、化疗药物与毒素等。 融合蛋白：由抗体片段和活性蛋白两个部分构成。理想的抗肿瘤分子靶点应具备下列3个特点： 特异性 重要性：生长与扩散将被抑制 可检测性 简述已上市抗体药物治疗哪些疾病抗肿瘤免疫疾病治疗器官移植抗感染心血管疾病第5章 疫苗及其制备技术疫苗（vaccine）：主要是指将病原微生物及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的免疫制剂。抗原具有免疫原性和免疫反应性。疫苗的类型： 减毒活疫苗 灭活疫苗 亚单位疫苗： 纯化亚单位疫苗 合成肽亚单位疫苗 基因工程亚单位疫苗 联合疫苗 核酸疫苗（未上市）治疗性疫苗（未上市）灭活疫苗特点（1）灭活疫苗常需多次接种；（2）接种灭活疫苗产生的抗体滴度随着时间而下降；（3）灭活疫苗需要量大。减毒活疫苗的优点：通过自然感染途径接种，诱导全面免疫应答，使机体获得较广泛的免疫保护；只需接种一次；可能引起水平传播，扩大免疫效果，增强群体免疫屏障；不需要佐剂，不需要浓缩纯化，价格低廉。减毒活疫苗的缺点：一般减毒活疫苗均保留一定残余毒力和 “返祖”现象；减毒活疫苗是活微生物制剂，可能造成环境污染而引发交叉感染等，并可能滞留在环境中形成传染源；缺损颗粒可能干扰疫苗的免疫效果；保存、运输等条件要求较高。亚单位疫苗：利用微生物的某种表面结构成分（抗原）制成、能诱发机体产生抗体的疫苗，称为亚单位疫苗（subunit vaccine）纯化亚单位疫苗：由单个蛋白或寡糖组成的疫苗，如从致病微生物中纯化出来的细菌脂多糖、病毒表面蛋白和去掉了毒性的毒素，称为纯化亚单位疫苗。需要佐剂增强免疫原性。需要大规模培养致病微生物，成本较高，具有病原微生物扩散的隐患。基因工程活载体疫苗：将抗原编码基因克隆入表达载体，用以转染细胞或真核细胞微生物及原核细胞微生物后得到的产物。多价疫苗（multivalent vaccine）预防由同一种病原微生物的不同亚型引起的传染病，例如23价肺炎多糖疫苗，由代表23种不同血清型的细菌多糖所组成，只能预防肺炎球菌的感染。一、灭活全毒疫苗制备方法举例流感全病毒灭活疫苗的制备毒种种子批的建立及检定（1）血凝素型别鉴定试验（2）病毒滴度（3）血凝滴度（4）无菌检查、支原体检查（5）外源性禽白血病病毒、禽腺病毒检测（6）毒种保存单价原液的制备 （1）病毒收获：（2）尿囊收获液检定及合并：（3）病毒灭活：（4）浓缩和纯化及除菌过滤：（5）单价原液保存：1基因工程活载体疫苗的特点可制备出不含感染性物质的亚单位疫苗、稳定的减毒疫苗及能预防多种疾病的多价疫苗。基因工程活载体疫苗具有减毒活疫苗相似的特点，可模拟天然感染途径；可操作性强，可以人为地设计成不同用途的疫苗或基因治疗转载系统。2.联合疫苗、结合疫苗、多价疫苗区别联合疫苗（combined vaccine）： 是由疫苗厂家将不同抗原进行物理混合后制成的一种混合制剂。结合疫苗（conjugate vaccine） 是通过化学方法将两种以上的抗原相互偶联而制成的疫苗。多价疫苗（multivalent vaccine）预防由同一种病原微生物的不同亚型引起的传染病，例如23价肺炎多糖疫苗，由代表23种不同血清型的细菌多糖所组成，只能预防肺炎球菌的感染。3.DNA疫苗和基因工程活载体疫苗区别 DNA疫苗是将编码外源性抗原的基因插入到含真核表达系统的质粒上，然后将质粒直接导入人或动物体内，让其在宿主细胞中表达抗原蛋白，诱导机体产生免疫应答。基因工程活载体疫苗：将抗原编码基因克隆入表达载体，用以转染细胞或真核细胞微生物及原核细胞微生物后得到的产物。4.基因工程亚单位疫苗和基因工程活载体疫苗区别基因工程亚单位疫苗（genetic engineering subunit vaccine）是指在分离出病原体特异抗原编码基因的基础上，将外源基因转入另外一个通常是非致病性的微生物（如大肠杆菌或酵母）内表达基因产物，然后通过分离和纯化而获得特异的蛋白质。 第6章 酶工程制药酶(Enzyme):具有催化活性和高度专一性的生物催化剂。酶的催化特点: 催化效率高； 专一性； 不稳定性； 酶的活性受到调节控制 酶的本质：蛋白质和核酸酶的分子组成（以蛋白质类酶为例）单纯酶：仅由蛋白质组成；结合酶（全酶）： 蛋白质部分：酶蛋白 辅助因子：金属离子、 小分子化合物酶分离纯化的一般程序： 1原材料的选择和预处理 2酶的分离（盐析、等电点沉淀、离心分离等技术等） 3酶的精制（凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析等） 4酶的浓缩干燥及结晶（旋转蒸发、透析等）固定化酶（immobilized enzyme）或固定化细胞（immobilized cell）：是将具有一定生理功能的酶或生物细胞，用物理或者化学方法将其固定，作为固体生物催化剂而加以利用的一种技术。 设计一个完整的实验分离提取胰蛋白酶？1.原材料选择及预处理：称取11.5Kg新鲜猪胰脏，在冰浴下剥除脂肪和结缔组织，在低温下用绞肉机绞碎胰脏 2.稀酸溶液提取：H2SO4调节PH至2.5-3.03.盐析：滤液加固体粉状硫酸铵进行盐析，使溶液至75饱和度 ；4.结晶微生物发酵法产酶的优点？一、固定化酶（细胞）的制备 1.固定化酶概念 2.酶（细胞）固定化的方法 3.常用的固定化酶载体材料 二、固定化酶(细胞)的性质和指标 三、固定化酶的应用 固定酶和固定化细胞的优点各是什么？ 怎样制备？2.固定化细胞的特点：优点：A . 无需进行酶的分离纯化B . 细胞保持酶的原始状态，固定化状态中酶的回收率高C . 细胞内酶比固定化酶稳定性高D . 细胞内酶的辅助因子可以自动再生E . 细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应F . 抗污染能力强缺点：A . 利用的仅是胞内酶，而细胞内多种酶的存在会形成不需要的副产物B . 细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制作用C . 载体形成的空隙大小影响高分子底物的通透性方 法优 点缺 点吸附法制作条件温和、简便、成本低、载体再生、可反复使用结合力弱，对pH、离子强度、温度等因素敏感，酶易脱落，酶的装载容量较小共价法载体与偶联方法可选择性大；酶的结合力强，非常稳定偶联条件激烈，易引起酶失活；成本高，某些偶联试剂有一定毒性交联法可用的交联试剂多，技术简易，酶的结合力强，稳定性高交联条件激烈，机械性能差包埋法包埋材料、包埋方法可选余地大，固定化酶的使用面广，包埋条件温和仅可用于低分子量的底物，常有扩散限制问题各种酶固定化方法的比较固定化酶载体材料（1）高分子载体（2）无机载体（3）复合载体（4）新型载体 一、酶反应器 二、酶工程的研究现状 突变酶和酶分子的定向进化 酶工程在制药工业中的应用 突变酶（mutational enzyme）：采用基因工程技术对天然酶基因进行剪切、修饰或突变，通过表达修改的基因获得的在酶学性质上符合需要的酶。 酶分子的定向进化在试管中模拟达尔文进化的过程，利用分子生物学手段在分子水平创造分子的多样性，结合灵敏的筛选技术，迅速得到理想的变异。突变酶（mutational enzyme）：采用基因工程技术对天然酶基因进行剪切、修饰或突变，通过表达修改的基因获得的在酶学性质上符合需要的酶。 定点突变：对酶的改造是在已知酶的结构与功能的基础上，有目的地改变酶的某一活性基团或模块，从而产生新性状的酶，故又称理性分子设计。酶定点突变的方法 ：寡聚苷酸引物诱变盒式诱变定向进化：在试管中模拟达尔文进化的过程，利用分子生物学手段在分子水平创造分子的多样性，结合灵敏的筛选技术，迅速得到理想的变异。 抗体酶（abzyme）是一类免疫系统产生的、具有催化活性的抗体。 第7章 发酵工程制药概念*发酵：泛指利用微生物制造或生产某些产品的过程。*发酵工程：培养活细胞以取得生物体或代谢产物的技术。*发酵工程制药：是指利用微生物发酵过程生产药物的技术。*一、发酵的定义*发酵是用生物催化剂（biocatalyst）使培养物质转变成产品的生物化学反应过程。生物催化剂通常是细菌、放线菌、真菌或其解体产物和动物植物细胞等。（一）微生物菌体发酵*是以获得微生物菌体细胞为目的产品的发酵。*初级代谢产物初级代谢产物是菌体对数生长期产生的产物，这类产物对菌体生长、分化和繁殖都是必需的。 *次级代谢产物从合成代谢的中间产物出发，细胞合成的一些生理功能不明确，化学结构特殊，而且对细胞生命并非必须的产物，这类产物称为次级代谢产物。次级代谢产物一般在菌体生长的稳定期合成。 （四）微生物转化发酵*利用微生物来进行生物化学反应称为微生物转化。脱氢反应、氧化反应、脱水反应、缩合反应、脱羧反应、氨化反应、脱氨反应和异构化反应等。四、发酵工程制药的特点和发展趋势（1）菌种（2）理论产量*（3）常温常压（4）防止污染（5）产品较单一（6）达到分子水平*（7）投资少、见效快*（8）还可用动植物细胞和工程菌诱变育种的类别物理诱变：利用辐射，诱发基因突变和染色体变异。化学诱变：应用有关化学物质诱发基因和染色体变异。*三、菌种保藏斜面低温保藏法石蜡油封藏法沙土管保藏法麸皮保藏法甘油悬液保藏法冷冻真空干燥法液氮超低温保藏法宿主保藏法*典型的发酵设备包括种子制备设备，主发酵设备，辅助设备（无菌空气和培养基的制备），发酵液预处理设备，粗产品的提取设备、产品精制与干燥设备、流出物回收、利用和处理设备等。（二）培养基灭菌方法对于大量的培养基和发酵设备的灭菌，最有效、最常用的灭菌方法是蒸汽灭菌（即湿热灭菌）。 *空罐灭菌（空消）*实罐灭菌（实消）*连续灭菌：高温短时（连消）*1.空罐灭菌（空消）温度较高灭菌时间较长 *2.实罐灭菌（实消）将培养基置于发酵罐中用蒸汽加热，达到预定灭菌温度后，维持一定时间，再冷却到发酵温度，然后接种发酵，这叫做实罐灭菌，又称分批灭菌。 *3.连续灭菌：高温短时连续灭菌法（连消）是指灭菌的操作的加热、保温维持、冷却这三个过程，在同一时间内进行。名词解释发酵：发酵是用生物催化剂（biocatalyst）使培养物质转变成产品的生物化学反应过程。前体物质：在药物的生物合成过程中，被菌体直接用于药物合成而自身结构无显著改变的物质称为前体 初级代谢产物：初级代谢产物是菌体对数生长期产生的产物，这类产物对菌体生长、分化和繁殖都是必需的。 次级代谢产物：从合成代谢的中间产物出发，细胞合成的一些生理功能不明确，化学结构特殊，而且对细胞生命并非必须的产物，这类产物称为次级代谢产物。次级代谢产物一般在菌体生长的稳定期合成。 发酵工业生产上常用的微生物主要有（B ）A 枯草芽孢杆菌，放线菌，酵母菌，霉菌B 细菌，放线菌，酵母菌，霉菌C 细菌，放线菌，酵母菌，青霉菌D 金黄葡萄球菌，放线菌，酵母菌，霉菌发酵过程中需要防止杂菌污染，大多数情况下设备要进行严格冲洗、灭菌，空气不需要过滤。（X）按培养基的形态分，培养基可以分为固体培养基和液体培养基。（X）培养基采用 （D）时，需在培养基进入发酵罐前，直接用蒸汽进行空罐灭菌。A、间歇灭菌B、实消C、连消D、空消（B）是在每批培养基全部进流入发酵罐后，就在罐内通入蒸汽加热至灭菌温度，维持一定时间，再冷却到接种温度。A、连续灭菌 B、实消 C、连消D、空消菌种保藏方法中保藏时间最短的（A）A、斜面低温保藏法 B、石蜡油封存法 C、砂土管保藏法 D、冷冻真空干燥保藏法 为了避免菌种衰退，应尽量增加传代次数。（X）*作为种子应具备的条件（p206）菌种的生长活力强生理状态稳定菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求无杂菌污染保持稳定的生产能力*发酵周期空罐灭菌、培养基的灭菌、接种、发酵过程、放罐和洗罐等过程，所用的时间总和为一个发酵周期。 三、发酵过程中的中间分析项目*发酵过程的中间分析是生产控制的指示，它显示了发酵过程中微生物的代谢变化，作为分析和控制发酵情况以及处理异常发酵的主要依据。 四、发酵过程的影响因素及控制 *目的：控制影响因素达到最佳发酵效果，获得最高的产品收率。 四、发酵过程的影响因素及控制（五）溶氧（六）CO2（七）泡沫（八）染菌影响因素（二） 营养物质3.磷酸盐：对抗生素发酵，采用生长亚适量浓度。*4.补料：在发酵过程中补加基质和前体，称为补料补料的目的是使菌体处于半饥饿状态。*发酵过程温度的选择有什么依据？菌种及生长阶段 培养条件：如通气的好坏。 菌种生长情况：如生长快慢 。名词解释接种量：移种的种子液体积和接种后发酵罐培养液体积之比称为接种量，一般采用5% 15%。 补料：在发酵过程中补加基质和前体，称为补料。连续发酵技术与与分批发酵相比，有哪些优越性？产率和产品质量稳定；机械化和自动化程度高；减少设备清洗、准备和灭菌时间，提高设备利用率，节省劳动力；发酵罐小，易控制反应速率和过程。什么是间歇式发酵？间歇培养时细胞生长过程中包括典型的生长周期分别是什么？是将发酵培养基组分一次性投入发酵罐，经灭菌、接种和发酵后再一次性的将发酵液放出的一种间歇式发酵操作类型。延滞期、对数期、稳定期、衰亡期发酵工程的内容包括了以下的基本步骤菌种的选育培养基的配置灭菌种子的扩大培养和接种发酵过程分离提纯（A）可采用高温短时灭菌，培养基受热时间短，营养成分破坏少。A. 连消B.实消C.间歇灭菌D.空消造成发酵染菌的原因有很多，尤以（C）造成染菌较为普遍且严重A.设备渗漏B.空气带菌C.A+BD.培养基灭菌不彻底控制泡沫的方法有化学消泡和机械消泡两种方法。（X）*代谢调控运用人为的方法对微生物的代谢调节系统进行遗传改造和条件的控制，在保证微生物适当生长的条件下，建立新的代谢方式，以期按照人们的意志有目的地过量积累所需的代谢产物，提高生产效率。*代谢工程利用基因工程方法改变代谢流，扩展和构建新的代谢途径，或将两个相关的代谢途径通过相关酶连接成新的代谢流，这种涉及多个基因的基因工程称为代谢工程，或途径工程。 *一、初级代谢与次级代谢初级代谢能使营养物质转变成机体的结构物质和对机体具有生理活性作用的物质，或是为机体生长提供能量的一类代谢。次级代谢存在于某些生物中（如某些植物和微生物），并在一定的生长期内出现的一类代谢。在抵御恶劣环境、伪装躲避、清除自身毒素和排泄物时很重要。第8章 微生物转化微生物转化（microbial transformation）是微生物通过酶催化将一种物质（底物）转化成另一种物质（产物）的化学反应。微生物转化反应的类型和应用实例（一）氧化反应（二）还原反应 （三）水解反应 （四）缩合反应 （五）其他 胺化反应 酰基化反应 脱羧反应 脱水反应 体外蛋白质药物化学修饰的意义 循环半衰期延长； 免疫原性降低或消失，毒副作用减小； 物理、化学和生物稳定性增强等。 (1)增大药物分子量，避免被肾小球过滤;阻碍蛋白酶的降解作用;(2)屏蔽药物的免疫位点;(3)赋予药物优良的理化性质，与药物间的化学键在体内随时间水解，缓慢释放药物 微生物转化反应的特点： 跟酶法转化和有机化学转化比较有以下特点 1.蛋白酶为催化剂 2.对立体结构合成上具有高度的专一选择性 3.反应速度高 4.反应条件温和优点：可在常温常压、接近中性pH的水溶液中进行，减少器材损耗与环境污染。对反应物与产物之立体异构物具有专一性。缺点：易受有机溶剂或极端酸碱度