行为学具体标准的操作方法.doc

行为学具体标准的操作方法，务必有参考文献整理我们之前做过的行为学具体标准的操作方法，务必有参考文献。这个比较简单。另外要开始学习细胞培养基础知识过段时间我带你做细胞实验 长：10.4宽：6.6高：18.1慢性社会挫败应激模型（chronic social defeated stress） 首先根据需要选取一定数量的CD1小鼠作为攻击性小鼠，在正式实验前2-3周开始对其攻击性进行蹄选。具体方法就是：每个饲养笼中饲养雄性和雌性两只周龄相近的CD1小鼠，一定时间内让CD1雄性小鼠产生领地意识；1周以后，将配对词养的雌鼠分离出饲养笼，随机放入一只陌生C57的小鼠作为领地入侵者，如果CD1雄性小鼠在1min之内就开始对C57小鼠发动攻击，那么该CD1小鼠则被视为攻击性CD1小鼠。运用同样的方法筛选出所有需要的攻击性CD1雄性小鼠44。正式实验前，选取雄性C57小鼠（7周），随机分配成正常组和应激组，每组10只，对照组每2只一笼，其余均单笼饲养，给予正常饮食饮水一周充分适应环境。当实验幵始时，提前分离CD1雌鼠，取模型组C57小鼠一只，直接放入陌生CD1雄性小鼠（8-9周）饲养笼中，使C57小鼠遭受雄性CD1小鼠持续性攻击约5-10min；然后将两只小鼠用带有密集小孔的透明塑料隔板隔开，使两只小鼠彼此仍能互视和闻嗅但是无法接触，运用这种方法持续到下次进行攻击前为止，完成该过程后即为第一天应激。第二天再将该C57鼠放入另一不同的CD1雄性鼠的笼中，使C57小鼠受到相同程度的应激；第三天再放入第三只CD1雄性鼠的笼中，同样使C57小鼠受到同样程度的应激。如此连续应激10天，并保证每天同一只C57小鼠受到不同CD1雄性鼠的攻击。在此期间，对照组和应激组C57小鼠均维持正常饮食饮水，而对照组则保持2只一笼，每天相互更换接触不同的小鼠。10天连续应激结束后即开始行为学测试。根据糖水消耗，社会接触的行为学和悬尾测试的结果将C57小鼠分为正常组，抑郁敏感组，抑郁非敏感组。糖水偏好实验糖水偏好测试是检测抑郁症快感缺失的经典方法。测试前用自来水配制好1%庶糖水，与不含鹿糖的正常自来水同时放在C57模型鼠的鼠笼处，保证其自由饮用，同时提供充足的鼠食，每12h将糖水和白水互换位置，以防止C57模型鼠产生位置偏好。到第三天将所有的水和食物同时撤走，将C57模型鼠禁食24h。禁食结束后分别称量糖水和白水的重量并记录，然后将两瓶水随机放在词养笼上供模型鼠自由饮用，1h后取下两瓶水分别测量两瓶水剩下的重量，计算出糖水消耗重量A和白水消耗重量B，利用公式A/(A+B)*100%即得到CSDS模型鼠的糖水偏好率。糖水偏好率的值与动物的快感程度呈正相关，其值越小则表明动物快感缺失越严重。社会接触实验 该实验方法主要用于检测小鼠对陌生目标的靠近，探索和躲避行为45。正常的喷齿类动物是社会性动物，当正常鼠与陌生鼠相遇后会与陌生鼠频繁接触；而遭受过社会挫败应激的小鼠则会产生孤立和逃避接触的行为，该行为一般判定为抑郁样行为；而相比之下，在一定的时间内，正常鼠在单位时间内与正常鼠接触的时间明显长于模型鼠在单位时间内与正常鼠接触的时间，因此，在规定时间内计算出模型鼠与攻击鼠接触的时间能反应出模型鼠的抑郁程度。其具体操作方法是：在敞箱（45*45*45cm）一侧的中央放入隔板（10*6cm，底部有密集小孔，用来放置CD1陌生小鼠），以中央放置CD1小鼠的区域为中心，划出一矩形区域作为接触区域（14*26cm）46。结果通过由Anilab公司提供的软件进行接触时间的统计。整个实验步骤如下：（1）打开软件和摄像头后将实验笼放置到合适的位置，并不断地调整保证充分的视角，最后进行软件的设置；（2）不放入陌生的CD1小鼠，然后放入C57小鼠，然后开始计时，时间设定为2.5min，最后得到接触区和非接触区的累积时间，此阶段为Target absent；（3）放入陌生的CD1小鼠，然后放入C57小鼠，然后开始计时，时间设定为2.5min，最后得到接触区和非接触区的累积时间，此阶段为Target present；（4）分别统计对照组和模型组的Target absent和Target present的累积时间，在Target absent阶段，对照组和模型鼠无明显差异，但是在Target present阶段，模型鼠的接触时间明显降低。悬尾实验将高60cm的架子放置于安静的实验环境中，用夹子夹住小鼠尾巴末端1cm处，然后将夹子固定在架子上，使其倒吊于架子上，小鼠为克服不正常体位而挣扎活动，在此期间记录小鼠的不动时间。总共时间6min，为开始1min为适应时间，随后5min为记录时间。44Tsankova NM,Berton O,Renthal W,Sustained hippocampal chromatin regulation in a mouse model of depression and antidepressant action.Nat Neurosci 2006;9:519-25.45E.Venzala.A.L.Garcia,N.Elizalde,Chronic social defeat stress model:behavioral features,antidepressant action ,and interaction with biological risk factors.Psychopharmacology 2012,224,313-25.46Wang X,Chen J,Li F,Lin Y.MIR-214 inhibits cell growth in hepatocellular carcinoma through suppression of -actenin.Biochem Biophys Res Commun.2012,30,428,525-31.1邓志芳.miR-214-3p对慢性社会挫败应激所致小鼠抑郁样行为的作用及机制.华中科技大学博士学位论文.2014.5.最初的社会挫败 模型是由Tornatzky和Miczek于1993 年在大鼠中建立的。模型建立过程如下:选取一批月龄、体重均较大的雄性啮齿动物为居住者，即攻击者，使其能在斗争中占主导地位。因体重和月龄的差异，二者存在从属关系，居住者会对入侵者进行攻击，当入侵者出现顺从、投降姿势、发出痛苦的叫声时，直到攻击过程结束4。然后将入侵者放入带孔、透明的保护笼中，再置于居住者笼中，此过程允许存在嗅觉、视觉、触觉接触，但无直接接触。而上述两攻击鼠对实验鼠攻击的两个过程进行的时间随着实验方式及实验动物的改变而进行调整。与其他应激一样，社会挫败同样能引起动物长期的行为学改变。当进行24d连续的社会挫败应激，大鼠自发活动和探索行为显著性降低5-6，攻击性和性需求减弱，更易于屈服和焦虑7。而且，如果进行更多天数的社会挫败，会导致一系列的抑郁相关行为改变。4Blanchard RJ,Blanchard DC.Aggressive behavior in the ratJ.Behav Biol,1977,21(2):197-224. 1桂舒佳,田绍文,谢明.社会挫败应激模型的研究进展J.社区医学杂志.2015,13(24):81-83. Chronic social defeat stress procedureThe CSDS procedure was carried out following Tsankova et al. (2006), with minor modifications. Briefly, experimental mice were submitted to social defeat stress for 10 consecutive days. Every day, each mouse was introduced into the home cage of an unfamiliar resident. Resident mice were CD1 retired breeders selected for their attack latencies reliably shorter than 30 s upon three consecutive screening tests. Once the experimental mouse had been physically defeated by three attacks, both animals (defeated and aggressor) were maintained in sensory contact for 24 h using a metallic mesh dividing the resident home cage into two halves.During the 10 days, control mice were individually housed in equivalent cages but with a member of the same strain in the other half of the cage.Tsankova等人（2006）简单地说，实验小鼠连续10天提交给社会失败压力。每一天，每H鼠标被引入一个陌生的居民的家庭笼子里。居民的小鼠CD1退休育种者选择攻击潜伏期短于30秒后可靠连续三屏幕宁试验。一旦实验老鼠已被心理物理攻击三，动物（打败侵略者）均保持在感官接触24小时使用金属网格划分将居民家庭的笼子分为两半，在10天里，对照组的老鼠被分别安置在相当的笼子里，但另一半的笼子里有一个相同的部分。Sucrose intake testAnhedonic-like behavior was evaluated by monitoring of sucrose intake (Elizalde et al. 2008). Every 10 days, mice were given a 15-h exposure to the sucrose solution (2.5 %) and tap water from 6:00 p.m. until 9:00 a.m. and, during this test, no stressors were applied. The position of the two bottles (right/left) was varied randomly from trial to trial. Body weight measurements were taken weekly and relative sucrose intake was calculated as absolute intake (in grams) perweight.Behavioral testsSpontaneous locomotor activityLocomotor activity was measured in an open field consisting of nine black square boxes with light gray floor (435045) using a video tracking system (Ethovision XT 5.0, Noldus Information Technology B. V., Wageningen, The Netherlands) in a softly illuminated experimental room. One mouse was placed in each cage, and the distance traveled (in centimeters) and speed were recorded at 10-min intervals during a 30-min period.Elevated plus mazeThe EPM consisted of two open arms (305 cm), two enclosed arms (305 cm), and a central platform (5 5 cm) elevated 38.5 cm above the ground in a softly illumi- nated room (50 lx). During a 5-min session, percentage of time in the open and central arms and number of head dips over the edge of the open arms were calculated (Ethovision XT 5.0 plus multiple body point module).Social interaction testThis test measured the approachavoidance behavior towards an unfamiliar social target (Tsankova et al. 2006). The arena is a transparent plastic open field (454545 cm) maintained in a very softly illuminated room (50 lx). Each experimental mouse was introduced into the open field and its trajectory was tracked for two consecutive sessions of 2.5 min. During the second session (“target”), a social target animal (an unfa- miliar dominant CD1 male mouse or a mouse from the same strain) had been introduced into a metallic mesh cage (10.5 9 cm) located at one end of the field. The time that the experimental mouse spent in the “interaction zone” (7 cm wide corridor surrounding the little metallic cage) both in the “no target” and “target” conditions were recorded (Ethovision XT 5.0 plus multiple body point module).Forced swimming testMice were placed individually for 6 min into glass cylinders (height, 24 cm; diameter, 13 cm) containing 14 cm of water, maintained at 2223 C. The duration of immobility was recorded during the last 4 min of the 6-min testing period (Ethovision XT).Tsankova NM, Berton O, Renthal W, Kumar A, Neve RL, Nestler EJ (2006) Sustained hippocampal chromatin regulation in a mousemod- el of depression and antidepressant action. Nat Neurosci 9:51925Elizalde N, Gil-Bea FJ, Ramirez MJ, Aisa B, Lasheras B, Del Rio J, Tordera RM(2008) Long-lasting behavioral effects and recognition memory deficit induced by chronic mild stress in mice: effect of antidepressant treatment. Psychopharmacology 199:114社会失败应激 每次随机将2只PS组小鼠放入同一 小鼠笼内5s，5s内小鼠均可产生攻击、防御、逃避、顺从等行为，待小鼠出现这种行为变化立即用双层铁丝网将二者隔开以避免躯体性接触，并保证二者均能看到对方，听到对方的声音，嗅到对方的气味，如此持续应激6-8min。群居饲养的NC组小鼠随机每2只放入同一小鼠笼内，5s后用双层铁丝网将二者隔开，持续6-8min。旷场实验 将小鼠置于(50*50*50cm)的旷场中心处，任其自由活动5min。实验全程使用摄像系统记录，记录小鼠5min内的行为变化，包括垂直运动（两前爪腾空或攀附墙壁）嗅探（连续嗅闻2s以上）水平运动（身体一半以上进入另一格）次数。每只小鼠实验完毕后均用清水对旷场实验箱进行擦拭并彻底干燥，避免残留气味对下一只小鼠的影响。实验完成后找3名对实验设计不熟悉的人员进行评分，求平均值。1徐东宝,王杰,于燕妮.联合应激法建立单纯心理应激动物实验模型的研究J.重庆医科大学学报.2016,41(8):832-835.糖水偏好测试 用于测定抑郁症的核心症状-快感缺乏状态。动物经过20h隔夜饮水摄食剥夺后，进行2h双瓶测定（一瓶饮用水，一瓶 1% 蔗糖水），记录每只大鼠测试期间水和糖水摄入量，计算糖水偏好指数（糖水摄入量与总的液体摄入量之比）。糖水摄入量或偏好指数的降低表示动物出现快感缺乏状态。1王琼,罗晓敏,绍枫.两种慢性应激诱导的抑郁模型大鼠前额叶认知功能的比较研究.中国神经精神疾病杂志.2012,38(8):449-453.社会失败应激 实验前将小鼠随机分为对照组和应激组，每天将应激组C57BL/6小鼠作为侵入者放入长期单独饲养CD1小鼠的笼内，进行身体接触10min。10min内 C57BL/6小鼠将受到CD1小鼠攻击并表现出逃跑、恐惧、顺从等从属性特征。10min后身体接触后，使用使用透明并且有很多小孔的有机玻璃板将二者隔开进行心理应激24h，保证C57BL/6小鼠能看到CD1小鼠，听到CD1小鼠的声音，而且能闻到 CD1小鼠的气味，应激持续21d。应激结束后， 将C57BL/6小鼠单独饲养，进行行为学评价。对照组则使用等当量的鼠笼饲养，2只对照组C57BL/6 小鼠成对隔开，并且每天将每只小鼠放置于掌心30s。待应激组应激结束后，对照组小鼠也进行单独饲养。开场实验 将小鼠置于42cm*42cm*25cm的旷场中心处，任其自由活动5min。实验全程使用摄像系统记录，记录小鼠5min内穿过中央区域的次数和总运动距离。视频采用 Ethovision ver 6.0 ( 软件进行分析$每只小鼠实验完毕后均使用75%乙醇对旷场进行擦拭并彻底干燥，避免对下一只小鼠的实验产生影响。社会交互实验 社会交互实验分为两个阶段，每个阶段2.5min。实验在42cm*42cm*25cm开场内进行。第一阶段将C57BL/6小鼠随机放置到所预定义的交互区域远端的两个角落处，交互区域内放置一个3cm*6cm*25cm的布满小孔的 塑料透明小盒，盒内不放置 CD1小鼠。第二阶段，向透明小盒内放置一只CD1小鼠，再将C57BL/6 小鼠放回到开场内，观察C57BL/6小鼠与CD1小鼠的交互情况。实验过程使用摄像系统记录，并使用Ethovision ver 6.0 ( 软件对小鼠在预定义的交互区域内的停留时间和交互区域远端两角落处停留的时间及其运动轨迹进行分析。糖水偏爱实验 社会失败应激进行至第19天即给予C57BL/6小鼠2瓶饮用水，供其选择性饮用，适应2d后，再换成2 瓶1%的蔗糖溶液，同样再选择性地适应2d。选择性饮水共进行5d后，正式进行糖水偏爱实验，给予小鼠一瓶饮用水和一瓶1%蔗糖溶液，24h 后，称量各水瓶消耗量。测试共进行2d，每天将饮用水瓶和蔗糖溶液瓶位置互换，消除位置偏爱可能带来的误差。1张飞龙,徐志伟,范礼斌.社会失败应激致抑郁样行为动物模型的研究J.军事医学.2011,35(3):193-196.C57小鼠CMS造模行为学分析流程及注意事项(一) 总体流程拍摄视频分析保存路径导出数据归纳分析统计数据。(二) 每部分注意事项1. 拍摄视频（雷雨、闪电等恶劣天气不宜做）。总体注意事项 必须先用一只小鼠试录一段视频，进行分析，保证录像的质量，并且保证在SMART软件中的视野足够，能够高效识别轨迹，进行准确分析。 每项行为学之前小鼠最好在行为学房间内适应24 h以上，不同的行为学间也要间隔24 h以上。 特别注意：为了保证一批小鼠的每项行为学的拍摄效果（如，焦距等）相同，每项行为学最好在一天内做完，如果小鼠数量较大，则最好在每天的同一时间段内做，并且试验期间要保证周围安静（拉帘）、光线（期间不要随意开关灯）、温度（可开启空调）。晚上则要在团队群里告知，不要随意碰摄像装备及其他相关设备，保证第二天继续同一行为学实验时焦距等的相同。 要保证先开始录像，再放小鼠。保证录像开始时的界面中没有小鼠和人。 所有行为学放小鼠时动作都要轻。 取放小鼠时动物幅度要小，避免碰到摄像头 。 每项行为学（尤其是高架十字迷宫和同时录制多只小鼠时）先录一只小鼠，然后用SMART软件进行预分析，保证小鼠的最大活动范围都出现在视野范围内，并且可以理想的跟踪其运动轨迹。 当实验期间不小心碰到架子时，要及时在实验记录本上记录清楚。从而判断哪些小鼠是同批次的。 若做完一批行为学后，距离下一次的行为学时间较长（一周以上），则要将镜头取下保存在柜子中，防止灰尘使镜头模糊。具体注意事项旷野实验： 若小鼠数量较多，可考虑同时用两个箱子。 最终要分析5min内的相关数据，加上前期的30s适应时间和放小鼠的时间，所以每只小鼠要录6min左右。 放小鼠时要将小鼠轻轻放在箱子的中央位置。 做完一只小鼠后，要用沾有酒精的抹布擦拭箱子的底部，小鼠停留较久的区域要着重擦拭，以去除上一只小鼠气味对后一只小鼠的影响。高架十字迷宫： 最终要分析5 min内的相关数据，加上前期放小鼠的时间，所以每只小鼠要录5.5 min左右。 放小鼠时要将小鼠轻轻放在箱子的中央位置，面朝开放臂方向。 做完一只小鼠后，要用沾有酒精的抹布擦拭箱子的底部，小鼠停留较久的区域要着重擦拭，以去除上一只小鼠气味对后一只小鼠的影响。由于空间较小，擦拭时要小心。悬尾实验： 若小鼠数量较多，可考虑同时用两个箱子。 可用白色绳子做好小圈，用纸胶布缠住离小鼠尾尖1-2cm处，然后另一端缠在事先准备好的白绳上。 在开始录制视频前最好保持小鼠在平面上，不要将其提起来。 挂小鼠时动作一定要轻，以免开始时不是小鼠的真实运动状态。 小鼠鼻子离箱底的高度最好保持一致，若同时录制两只小鼠，期间一只上爬或者脱落，则不管，保证另一只的录制效果。 最终要分析6 min内的相关数据，加上前期放小鼠的时间，所以每只小鼠要录6.5 min以上的时间。 录完一只小鼠后，最好将箱子底部的小鼠屎擦掉。强迫游泳： 若小鼠数量较多，可考虑同时用两个或三个桶。 若用两个以上的桶，则要保持放小鼠时动作的同一性。 录完一次后，要及时更换水，并要调整水温和水面高度。 录完后，要及时用纸和毛巾擦干小鼠身上的水分，并放到温暖处，防止小鼠感冒。(三) SMART软件使用1. 软件是正版软件，必须在308实验室的电脑上加密码狗才能正常使用。2. 软件工作原理： 识别的是黑白颜色，所以黑鼠用白色背景，白鼠用黑色背景。 跟踪路径时的箭头方向为某一部分的瞬时移动速度（为横向和纵向的合成速度），其识别的灵敏度要比人高，所以主观上判断不动时，显示的速度不一定为绝对0。3. 软件界面关键参数： Calibration：与导出结果中距离、速度等相关参数直接相关。所以分析数据时必须先设定Calibration的参数，才能保证导出结果中距离、速度等相关指标的准确性。注意：此参数必须在记录运动轨迹前设置好，并且每项行为学测试时都要重新设置，因为每项行为学所需的设备的规格不同，必须调整