手足口病RT-PCR检测标准操作程序_TianGen_1_2.doc

河南省CDC传染病预防控制所分子生物学实验室病原检测标准操作程序 内部标准手足口病RTPCR检测标准操作程序（试用）（2008年5月22日第1版，2008年5月29日修改）内部标准编号：检测项目：肠道病毒EV71、CA16，其他肠道病毒检测方法：RTPCRPCR仪器：BioRad iCycler1. 检测原理根据已知肠道病毒5UTR区基因序列及EV71、CA16的VP1VP3基因序列，设计特异性引物（PE、EV71、CA16），通过Nested RTPCR扩增基因片段，检测标本中是否存在肠道病毒EV71、CA16和其他肠道病毒。所用引物序列、扩增产物大小和配制如下：引物核酸序列(53)产物长度加DEPC水量(uL)（1 OD配制25 uM）PE2TCC GGC CCC TGA ATG CGG CTA ATC C116 bp156PE1ACA CGG ACA CCC AAA GTA GTC GGT CC 180EV71-SGCA GCC CAA AAG AAC TTC AC226 bp196EV71-AATT TCA GCA GCT TGG AGT GC208CA16-SATT GGT GCT CCC ACT ACA GC208 bp220CA16-ATCA GTG TTG GCA GCT GTA GG2082. 应用的范围检测血清、血浆、粪便、咽拭、疱疹液、脑脊液等标本中肠道病毒EV71型和CA16型病毒基因片段。3. 标本处理3.1 粪便标本处理：3.1.1将1.5ml Eppendorf管上标记标本号;3.1.2每一管中加入900ul生理盐水、100ul 氯仿;3.1.3在生物安全柜中将每一份粪便标本取大约0.1g约绿豆大小，加入标记好的离心管中，剩余原始标本最好留在原容器中并冻存于 - 20。3.1.4 确保拧紧离心管，用机械振荡器剧烈振荡20min。3.1.5 1500g* （约3500转）离心20分钟。3.1.6 将每一份标本上清吸入新1.5ml Eppendorf管中。注意：若上清不清澈，应再用氯仿处理一次。以上标本处理方法适用于从患者排泄物、呕吐物（均简称样品）中提取病毒RNA。3.2咽拭子标本处理咽拭子要在保存液中充分搅动（40下左右）或用机械振荡器剧烈振荡510min，以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等，然后10000rpm离心20min或4静置10min，取上清吸入2个有外螺旋盖的标记好的冻存管中。注意：以上标本处理方法适用于从疱疹液拭子、肛拭子（均简称样品）中提取病毒RNA。脑脊液、血清标本不需要处理可直接用于RNA提取。3.3 提取病毒RNA模板应用RNA提取试剂盒（TianGEN公司产品，Cat. No：DP315-R）方法试剂准备：a 打开新试剂盒，需将310uL Rnasefree ddH2O加入310ug Carrier RNA获得1 ug/uL的溶液。溶解后需分装保存于-20。（每管分装56uL可做10次提取）。此溶液反复冻融不能超过3次。b Carrier RNA工作液配置：根据样品的数量计算所需裂解液RL和Carrier RNA溶液的体积，将裂解液RL与Carrier RNA溶液颠倒混匀，即得到Carrier RNA工作液。为避免溶液出现气泡现象，请勿使用涡旋振荡。 N 0.56 mLY mL Y mL 10 uL/mL=Z uLN样品数目；Y裂解液RL溶液体积；Z需加入Carrier RNA溶液体积注意Carrier RNA冻干粉不能直接溶解于裂解液RL中，必须先溶解在Rnasefree ddH2O中，再溶解至裂解液RL中。溶解后2-8最多能保存48小时，最好现用现配。c 缓冲液GD、漂洗液RW 为浓缩液，第一次使用前加入无水乙醇（试剂瓶上标注的量）混匀，室温可储存1年。-提取病毒RNA模板：3.3.1 吸取560 l 含有Carrier RNA的RL到1.5ml Eppendorf离心管中。3.3.2 加140 l 1标本到上述离心管中，回旋振荡15秒。3.3.3 室温（1525）孵育10 min。3.3.4 短暂离心一次。3.3.5 加560 l乙醇（96100）到离心管中，盖上离心管帽，回旋振荡15秒。短暂离心一次。3.3.6 从离心管中吸取630 l溶液至Rnase-free吸附柱CR2中，注意不要滴到柱子边缘上。盖上离心管帽，6000g（8000rpm）离心1 min。用移液器把吸附柱套管中的滤液吸出弃掉，将套管套回原吸附柱中。3.3.7 重复第6步的步骤。3.3.8 加500 l 缓冲液GD，盖上离心管帽，6000g（8000rpm）离心1 min。用移液器把吸附柱套管中的滤液吸出弃掉，将套管套回原吸附柱中。3.3.9 加500 l漂洗液RW，盖上离心管帽，6000g（8000rpm）离心1 min。用移液器把吸附柱套管中的滤液吸出弃掉，将套管套回原吸附柱中。3.3.10 13400g（12000rpm）离心3 min。用移液器把吸附柱套管中的滤液吸出弃掉，将套管套回原吸附柱中。3.3.11 可选：打开吸附柱盖子，室温放置3min，使吸附膜完全变干。3.3.12 将吸附柱放入一个新的1.5ml 无RNA酶离心管中，打开柱子帽，加入60l Rnasefree ddH2O，盖上盖子，在室温孵育5min，6000g（8000rpm）离心1 min。3.3.13提取的病毒RNA模板可立即进行逆转录，或贮存于70备用。4. RTPCR反应4.1 准备引物4.1.1 引物溶解方法4.1.1.1 将盛放冻干引物干粉的Eppendorf离心管放入离心机，插入离心管时应注意放置方向，10000rpm离心10min。4.1.1.2 小心取出离心管，放置到合适的试管架上，在PCR实验室的“准备间”溶解稀释引物。4.1.1.3 小心打开Eppendorf管，按照4.2“引物加水配制表”加入RNasefree ddH2O，用枪头仔细搅刮或吹打离心管底部引物沉淀处，使引物充分溶解至水中，关闭离心管盖，在回旋振荡器上振荡10min。短暂离心，使管壁液体集中到管底。4.1.2 引物加水量 引物加水稀释，配制成25uM的母液，各引物每管（1 OD）加水量如下表引物加水配制表引物名加水量引物名加水量引物名加水量PE1156 uLEV71A208 uLCA16A208 uLPE2180 uLEV71S196 uLCA16S220 uL4.2 一步法逆转录PCR（RTPCR）（中国CDC全国学习班推荐方法）配制如下逆转录及PCR反应体系（TianGen公司RTPCR试剂盒）组分名称单标本PE2/PE1EV71-SEV71-ACA16-S CA16-ADEPC H2O25.3 uL10RT-PCR buffer5.0 uLdNTPs(2.5mM)2.0 uL5RT-PCR enhancer10 uLRnasin(40U/ul)0.5 uLHotmaster Taq (2.5U/ul)2.5 uLQuant RTase0.5 uL上游引物（25uM）0.6 uL下游引物（25uM）0.6 uL模板RNA3 uL总体积50 uL程序：5040分钟；945分钟；9430秒，5040秒，6550秒，35个循环；6510分钟。（总时间约170分钟）5. 结果判断PCR产物行2%琼脂糖凝胶电泳，出现相应长度的扩增产物即为该基因检测阳性。（产物：EV71S-EV71A引物：226bp；CA16S-CA16A引物：208bp; PE2PE1引物：116bp）6. 检测的局限性待查7. 参考文献7.1 中国疾控中心网站，手足口病专题，EV71、CA16检测方案7.2 其他中外文文献第1版制定人：马宏 杜燕华 制定时间：2008年5月22日第1版修订人：马宏 杜燕华 修订时间：