引物设计心得、Primer5.0 使用.doc

引物设计、选择核酸内切酶、酶切位点之Primer5.0使用下面以 目的基因CD63 为例，介绍一下真核表达载体PcDNA3.1(+)-CD63的构建过程1 cd63基因序列的获取打开 NCBI-选择输入 cd63 回车找到第16条 编码为 1 的打开后 可见该积基因的详细信息，找到 CDS（编码序列）可见其编码序列为第146到862位碱基，继续往下拉，可见基因序列，选中编码序列（146-862）复制，打开Primer 5.0（起始密码子）ATGgc ggtggaagga ggaatgaagt gtgtcaagtt 181 tttgctctac gttctcctgc tggccttctg cgcctgtgca gtgggattga tcgccattgg 241 tgtagcggtt caggttgtct tgaagcaggc cattacccat gagactactg ctggctcgct 301 gttgcctgtg gtcatcattg cagtgggtgc cttcctcttc ctggtggcct ttgtgggctg 361 ctgtggggcc tgcaaggaga actactgtct catgattaca tttgccatct tcctgtctct 421 tatcatgctt gtggaggtgg ctgtggccat tgctggctat gtgtttagag accaggtgaa 481 gtcagagttt aataaaagct tccagcagca gatgcagaat taccttaaag acaacaaaac 541 agccactatt ttggacaaat tgcagaaaga aaataactgc tgtggagctt ctaactacac 601 agactgggaa aacatccccg gcatggccaa ggacagagtc cccgattctt gctgcatcaa 661 cataactgtg ggctgtggga atgatttcaa ggaatccact atccataccc agggctgcgt 721 ggagactata gcaatatggc taaggaagaa catactgctg gtggctgcag cggccctggg 781 cattgctttt gtggaggtct tgggaattat cttctcctgc tgtctggtga agagtattcg 841 aagtggctat gaagtaatgt ag 其中 tag（UAG）终止密码子，设计引物的时候需要将其删除，因为，真核表达载体上多含有标签序列，目的基因与载体链接后，在目的基因的下游即为标签序列，如果不去除上述终止密码子，则目的基因转录的时候就会在此终止，标签序列就不会得到表达，为后续帅选阳性克隆等实验带来困难！点击 file-new-DNA sequence-将编码序列复制（ctrl V）选择 As is2 限制性内切酶的选择通过 查看 PcDNA3.1（+）载体图谱，选择合适的内切酶，筛选的标准是，目的基因序列内不存在该酶的酶切位点，以及选择实验室内常用的已有的酶。另外pcDNA3.1（+），和（-）的含义是 都是多克隆载体，只是多克隆位点区有差异，应用都是一样的，都可以做真核表达我们可知载体上存在这些酶切位点结合本实验室拥有哪些常用的酶选择合适的两个酶科技楼常用 BamH I、Xho I、Hind III、EcoR I、Pst I、Bgi II这几种酶，所以尽量选择这几种，以便省去买那些不常用的酶，造成浪费下面看点击 Enzyme，将刚才我们列出的几种酶从左面导入到右面，点击 OK出现Pst I这种酶在目的基因内部第 625个碱基出存在酶切位点，则该酶不能使用，我们可以从BamH I、Xho I、Hind III、EcoR I、Bgi II中选择两个，两个酶切位点之间相距不要太近，以免因为空间位阻影响酶的切割效率，上图左边为上游酶切位点，右面为下游酶切位点，上下游各选择一个，故我们可以选择Hind III和Xho I、BamH I和Xho I、HindIII和XhoI 几种组合，又因为每种酶发挥效能时需要合适的液体环境，即Buffer，我们尽量选择两种酶都能正常使用的 Buffer，见下表：我们选择了Hind III和Xho I ，查表可知 应选用 1M Buffer这样酶切位点和酶，buffer都选好了，下面开始设计引物3 引物设计点击 Primer-左上角file-preferences 可以选择引物的长度，一般是18-26个碱基，我们可以从18开始，逐渐试，以选出最优引物长度S 代表上游引物，序列和目的基因5端碱基序列一样，图中显示对18个碱基的上虞噢引物的评价，里面有多个指标以评价引物质量，全是None的时候最好，如果不能满足，则 至少要让False Primering这一项是None，如果都无法满足，则只能凑合用了，接下来可以设定19个、20个.碱基的长度，不一一列举了。这样我们选择的上游引物长18bp，点击 Edit Primers，可以将引物序列复制出来5ATGGCGGTGGAAGGAGGA-3 设计下游引物，点击 A 将滚动条拖到最右端，设定长度，再选择，结合评价选择合适的下游引物我们选择 20bp，点击 Edit Primers，可以将引物序列复制出来5-CATTACTTCATAGCCACTTC-3 下游引物其实就是目的基因序列从3端开始的20个碱基的反向互补序列（具体可以参照基因序列自己体会）引入酶切位点和 保护性碱基（酶作用时形成粘性末端，故需在酶切位点的5端加上几个保护性碱基，以使酶正常发挥作用）常见酶切位点和保护性碱基酶寡核苷酸序列链长切割率%2 hr20 hrAcc IGGTCGACC CGGTCGACCG CCGGTCGACCGG 8 10 120 0 00 0 0Afl IIICACATGTG CCACATGTGG CCCACATGTGGG8 10 120 90 900 90 90Asc IGGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA8 10 1290 90 9090 90 90Ava ICCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA8 10 1250 90 9090 90 90BamH ICGGATCCG CGGGATCCCG CGCGGATCCGCG8 10 1210 90 9025 90 90Bgl IICAGATCTG GAAGATCTTC GGAAGATCTTCC8 10 120 75 250 90 90BssH IIGGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA8 10 120 0 500 0 90BstE IIGGGT(A/T)ACCC9010BstX IAACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT22 24 270 25 250 50 90Cla ICATCGATG GATCGATC CCATCGATGG CCCATCGATGGG8 8 10 120 0 90 500 0 90 50EcoR IGGAATTCC CGGAATTCCG CCGGAATTCCGG8 10 1290 90 9090 90 90Hae IIIGGGGCCCC AGCGGCCGCT TTGCGGCCGCAA8 10 1290 90 9090 90 90Hind IIICAAGCTTG CCAAGCTTGG CCCAAGCTTGGG8 10 120 0 100 0 75Kpn IGGGTACCC GGGGTACCCC CGGGGTACCCCG8 10 120 90 900 90 90Mlu IGACGCGTC CGACGCGTCG8 100 250 50Nco ICCCATGGG CATGCCATGGCATG8 140 500 75Nde ICCATATGG CCCATATGGG CGCCATATGGCG GGGTTTCATATGAAACCC GGAATTCCATATGGAATTCC GGGAATTCCATATGGAATTCCC8 10 12 18 20 220 0 0 0 75 750 0 0 0 90 90Nhe IGGCTAGCC CGGCTAGCCG CTAGCTAGCTAG8 10 120 10 100 25 50Not ITTGCGGCCGCAA ATTTGCGGCCGCTTTA AAATATGCGGCCGCTATAAA ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA12 16 20 24 280 10 10 25 250 10 10 90 90Nsi ITGCATGCATGCA CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT12 2210 9090 90Pac ITTAATTAA GTTAATTAAC CCTTAATTAAGG8 10 120 0 00 25 90Pme IGTTTAAAC GGTTTAAACC GGGTTTAAACCC AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG8 10 12 240 0 0 750 25 50 90Pst IGCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT8 14 22 24 260 10 90 90 00 10 90 90 0Pvu ICCGATCGG ATCGATCGAT TCGCGATCGCGA8 10 120 10 00 25 10Sac ICGAGCTCG81010Sac IIGCCGCGGC TCCCCGCGGGGA8 120 500 90Sal IGTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA28 30 320 10 100 50 75Sca IGAGTACTC AAAAGTACTTTT8 1210 7525 75Sma ICCCGGG CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA6 8 10 120 0 10 9010 10 50 90Spe IGACTAGTC GGACTAGTCC CGGACTAGTCCG CTAGACTAGTCTAG8 10 12 1410 10 0 090 90 50 50Sph IGGCATGCC CATGCATGCATG ACATGCATGCATGT8 12 140 0 100 25 50Stu IAAGGCCTT GAAGGCCTTC AAAAGGCCTTTT8 10 1290 90 9090 90 90Xba ICTCTAGAG GCTCTAGAGC TGCTCTAGAGCA CTAGTCTAGACTAG8 10 12 140 90 75 750 90 90 90Xho ICCTCGAGG CCCTCGAGGG CCGCTCGAGCGG8 10 120 10 100 25 75Xma ICCCCGGGG CCCCCGGGGG CCCCCCGGGGGG TCCCCCCGGGGGGA8 10 12 140 25 50 900 75 90 90则引入酶切位点后的引物序列为上游引物CD63-F 5- CCCAAGCTTGCCACCATGGCGGTGGAAGGAGGA-3CCC为保护性碱基，蓝色字体为 Hind III酶切位点，在酶切位点后引入kozak序列（kozak序列存在于真核生物mRNA的一段序列,其在翻译的起始中有重要作用。 核糖体能够识别mRNA上的这段序列,并把它作为翻译起始位点，GCCACC与后面ATG形成为kozak序列下游引物CD63-R ：5-CCGCTCGAGCATTACTTCATAGCCACTTC-3这样我们就设计好了目的基因扩增所需的 上下游引物以及为后续构建重组质粒所需的酶切位点。下一步，PCR扩增目的基因，扩增体系，程序见前期发的心得，扩增产物经琼脂糖电泳分离，DNA胶回收试剂盒回收目的片段分别对目的片段和pcDNA3.1 空载体行 Hind iii 、Xho I双酶切，琼脂糖电泳分离酶切后的片段，将