铜胁迫对红豆幼苗生理生化指标的毒害作用.doc

铜胁迫对红豆幼苗生理生化指标的毒害作用李沁 杨唐惠子 杨瑶南京师范大学教师教育学院12级生物师范 南京 江苏 210023摘要：用施加0mg/L、10mg/L、30mg/L、50mg/L不同铜离子浓度溶液的方法研究了铜离子对红豆幼苗生长的影响及测定植物体内生理生化指标的情况。结果表明：在实验的铜离子范围内，铜离子浓度越高，叶绿素含量减少，抑制了红豆幼苗根与株高的伸长，同时对MDA、POD、可溶性糖的生成有促进作用。关键词：红豆幼苗；铜；铜吸收铜是植物生长必需的微量营养元素，对植物生长有着重要的作用，但过量的铜会对植物产生毒害作用，使植物的水分代谢、光合作用、呼吸作用等各项生理代谢发生紊乱，使植物生长缓慢。红豆幼苗遭到铜离子污染后，严重影响红豆的生长发育。本次实验通过用施加0mg/L、10mg/L、30mg/L、50mg/L不同铜离子浓度溶液的方法研究了铜离子对红豆幼苗生长的影响及测定植物体内生理生化指标的情况，并初步探讨了植物对铜离子的适应性机理。1、 实验材料与方法1.1、实验材料：红豆幼苗1.2、试验设计：当红豆幼苗长出真叶的时候施加0mg/L、10mg/L、30mg/L、50mg/L不同铜离子浓度溶液，7天后实验红豆生理生化指标。1.3、叶绿素含量及其胡萝卜素含量测定1.3.1、提取：叶片去除中脉，洗净、吸干、称取0.3g左右，记录重量后于研钵中加入5mL 80%丙酮、少许石英砂和碳酸钙，研磨匀浆后过滤，再用5mL 80%丙酮冲洗滤渣，混匀，滤渣应该接近灰白色。如果仍偏绿，需要将滤液倒回漏斗再次过滤。用量筒量滤液体积。 1.3.2、测定：以80%丙酮调零，测定叶绿素提取液在645nm、663nm和470nm处的光吸收值。1.3.3、计算：叶绿素a：C=12.21A 663 -2.81A 645叶绿素b：C=20.13A 645 -5.03A 663叶绿素a/叶绿素b=?1.4、植株高度测定：将植株从盆中取出，洗净蛭石后测量茎高，同浓度Cu2+处理的植株茎高取平均，比较不同浓度Cu2+处理对植株茎生长的影响。1.5、植株根长：将植株从盆中取出，洗净蛭石后测量主根长度，同浓度Cu2+处理的植株主根长度取平均，比较不同浓度Cu2+处理对植株根生长的影响。1.6、MDA及其可溶性糖的测定1.6.1、MDA的提取：称取剪碎的试材0,3g，加入2ml l0TCA和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8mlTCA进一步研磨，匀浆在4000rmin-1离心10min，上清液为样品提取液。1.6.2、显色反应和测定：吸取离心的上清液2ml(对照加2ml蒸馏水)，加入2ml 06TBA溶液，混匀物于沸水浴上反应15min（自有小气泡产生后计时），自来水迅速冷却后再离心（4000g）10min。取上清液测定532、600和450nm波长下的消光度。1.6.3、计算含量MDA浓度(mol / L) 6.45（A532A600） 0.56A450MDA含量mol(g FW) c(MDA浓度) x V（提取液体积mL）x 10-3 / (g FW) (植物组织鲜重)可溶性糖的浓度(mmol/L)1171A4501.7、POD测定：1.7.1、配制反应液：0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH6.0） 50ml +愈创木酚 28uL +H2O2(30%) 19uL（将磷酸缓冲液水浴加热，加入愈创木酚并不断摇匀，完全溶解后冷却、加入H2O2。一般临用前配制，冰箱内短期保存。）1.7.2、提取酶液：叶片0.5g + pH6.0磷酸缓冲液5mL（预冷）冰浴研磨，转入离心管，离心（4000rpm 15min），上清液定容至10mL，即为粗酶液。1.7.3、测定：波长调至470nm预热，以3mL 反应液+ 0.2mL 提取液调零。3mL反应液+0.2mL粗酶液，震荡混匀并立刻记时，测OD470，30S内读第一次数，之后每10S读数一次，至OD值3.000。（如酶反应速度太快，可用提取液稀释后再测）1.7.4、计算：选取OD值变化较均匀的一段数据，代入公式计算；以每分钟OD值变化0.01作为1个酶活力单位（U）。过氧化物酶活性U/(gFWmin)=A470（VT/WVS0.01t）2、 原始数据的处理2.1、红豆幼苗根长测定（表1）铜离子浓度（mg/L）0103050编号118.500013.500016.000015.5000编号216.000016.500015.50009.5000编号311.000015.500017.500013.5000编号417.000015.500017.500015.0000编号517.000018.000014.500015.3000编号620.500015.500010.000011.5000平均值（cm）16.666715.750015.166713.38332.2、红豆幼苗株高测定（表2）铜离子浓度（mg/L）0103050平均值（cm）25.423.220.715.22.3、光合色素含量测定（表3）OD663 OD645 OD470 CaCbCA/CBCX1.9390 0.8790 1.7130 22.2608 11.0546 2.0137 1.6618 1.4450 0.6630 1.3140 16.5680 8.4201 1.9677 1.3067 0.7760 0.3720 0.7250 8.8545 4.8871 1.8118 0.6111 0.3920 0.2060 0.4150 4.4243 2.8828 1.5347 0.3155 2.4、过氧化物酶含量测定（表4）铜离子浓度（mg/L）0103050质量（g）0.29080.29520.29880.298530s（OD470）0.0590.0860.1020.14740s（OD470）0.0810.1150.1350.18250s（OD470）0.1040.1420.1650.21660s（OD470）0.1220.1680.1940.24970s（OD470）0.1420.1940.2210.28480s（OD470）0.1640.2170.2460.31990s（OD470）0.1870.2350.2840.348过氧化物酶4401.65065047.42546091.03076733.66832.5、MDA及其可溶性糖含量测定（表5）铜离子浓度（mg/L）OD600OD532OD450可溶性糖浓度MDA浓度500.07100.20400.51205.99550.5711300.06500.19000.43705.11730.5615100.04900.16100.37504.39130.512400.03300.13900.33403.91110.49673、结果与分析3.1、铜离子浓度对红豆幼苗根长的影响3.1.1、根系是直接受重金属毒害的器官。在实验培条件下，红豆幼苗用不同浓度Cu2+处理后根系净伸长量见图1。红豆幼苗用不同浓度Cu2+处理后株高伸长量见图2。3.1.2、结果分析：Cu2+对红豆植株的株高和根长的作用有一致性，植株的高度和根长与Cu2+的浓度呈显著负相关，均为抑制作用。随着Cu2+ 浓度的增加，下降趋势增加。浓度为10mg/L时，根长下降了5.50%，株高下降了8.66%，而浓度为50mg/L时，根长下降了19.70%，株高下降了40.16%，下降十分明显。株高降低的原因主要在于铜使植株老叶枯黄萎蔫，同时又抑制新叶的正常生长，生长受到限制。而铜在根部的积累抑制根系生长，养分吸收能力下降，同时也导致了株高的降低。3.2、铜离子浓度对光和色素含量的影响3.2.1、在实验培条件下，红豆幼苗用不同浓度Cu2+处理后叶绿素含量的变化见图3、CA/CB的变化趋势见图7、胡萝卜素含量的变化见图8。3.2.2、结果分析：当培养的对照组与染毒组所有幼苗到第7d时，测定各组叶绿素含量，结果见表3.由表3可知，幼苗叶绿素与胡萝卜素含量随溶液中Cu2+增大而减小,尤其是胡萝卜素的变化更显著Cu2+ 的浓度为10mg/L时的胡萝卜素浓度为不胁迫的浓度的78.63%，而当Cu2+浓度增加到50mg/L时，胡萝卜素浓度仅为不添加Cu2+的18.98%，急剧下降；叶绿素a/b值也随着染毒浓度的不断增加而减小，且对外界重金属胁迫反应比较敏感，这是由于重金属首先破坏叶绿素a的缘故。Cu2+对植物叶绿素的破坏作用，这可能与叶绿素的合成与分解代谢过程受到影响有关。一方面，Cu2+进入植物伴内使叶绿素酶活性比倒失调致使C叶绿素分解加快，另一方面，由于铜局部积累过多，与叶绿体中蛋白质的-SH结合或取代其中Fe2+、Zn2+、Mg2+，使得叶绿体蛋白质中心离子组成发生变化，破坏了叶绿体结构和功能，此外高铜抑制根系生长，养分吸收能力下降，造成铁缺乏，同样导致叶绿素合成降低。Cu2+对植物幼苗生理功能的破坏程度取决于对光和色素的破坏，进而影响到植物赖以生存的光合作用过程，最终的结果是由于光合作用效率的下降使植物体的其他生理功能受到连锁抑制效应，导致植物体代谢衰竭而死亡。3.3、铜离子浓度对POD含量的影响3.3.1、在实验培条件下，红豆幼苗用不同浓度Cu2+处理后POD变化见图4。3.3.2、结果分析：POD广泛分布于植物各组织器官，是植物体内清除自由基最关键的保护酶之一，清除体内自由基，以避免自由基积累对生物膜造成破坏。在铜离子的胁迫下，POD活性变化剧烈。Cu2+浓度为10mg/L，POD浓度增加了14.67%， Cu2+浓度为30mg/L，POD浓度比浓度为10mg/L增加了20.68%，而Cu2+浓度为50mg/L比30mg/L，POD浓度值增长了10.55%，增长幅值略微减小。但无论增长幅值大小，红豆POD浓度与Cu2+浓度都呈正相关。铜胁迫下，POD活性急剧增强，可能是由于铜过剩，引起H202急剧增加，刺激POD活性上升。3.4、铜离子浓度对MDA含量的影响3.4.1、在实验培条件下，红豆幼苗用不同浓度Cu2+处理后MDA含量变化见图5。3.4.2、结果分析：MDA 是植物逆境条件下产生的一种过氧化产物, 可与蛋白质、 核酸、 氨基酸等活性物质交联, 形成不溶性的化合物 ( 脂褐素 ) 沉积 , 从而干扰细胞的正常生命活动，因此被作为反映植物抗逆性强弱的一个重要指标。铜胁迫也会加重膜脂的过氧化作用, 从而使 MDA 含量增加。图 5 显示, 增加环境中铜的浓度将明显提高小麦叶片中 MDA 的含量。特别在环境中的 Cu 2+ 浓度由10mg/L增至30mg/L时,MDA 的含量迅速提高9.59%。3.5、铜离子浓度对可溶性糖含量的影响3.5.1、在实验培条件下，红豆幼苗用不同浓度Cu2+处理后可溶性糖含量变化见图6。3.5.2、结果分析：在营养液中添加0一50mgL Cu2+，红豆体内可溶性糖浓度的变化如表5及图6所示，随着铜离子浓度的增加，红豆体内的可溶性糖也平稳上升。可溶性糖是一种主要的渗透调节物质，在强度不是太大的胁迫条件下，渗透调节物质含量提高，可提高细胞液浓度，降低其渗透势，是一种对外界胁迫的适应调节。适当浓度铜处理时可溶性糖增加，可能是体内高分子碳水化合物如淀粉分解加强，而合成受抑，光合产物形成过程中，直接转向形成低分子量物质如蔗糖等。4、 实验总结 铜胁迫下，红豆生长受到抑制，使得生物量降低，从本实验来看，其生物量降低的机理体现在以下五个方面： 植物根系是活跃的吸收器官和合成器官, 它直接影响植物地上部的生长状况。铜在根部的积累影响根系的正常生长，甚至伤害红豆根系，导致根系活力下降，吸收机能受到干扰，水分和养分吸收不平衡，影响植株的正常生长代谢，进而使红豆植株变矮，根长变短。 实验结果表明, 营养液中的铜一定浓度会降低小麦叶片的叶绿素含量, 这可能与叶绿素的合成与分解有关。一方面, 铜进入植物体内可使叶绿素酶活性比例失调, 致使叶绿素分解加快 ; 另一方面, 由于铜局部积累过多, 与叶绿素中蛋白质的- SH 结合或取代Fe 2+ 、Zn 2+ 、 Mg 2+ 等, 使得叶绿素蛋白中心离子组成发生变化, 破坏了叶绿素的结构和功能。此外, 铜胁迫通过抑制根系生长, 使根系的养分吸收能力下降, 造成铁缺乏, 也会导致叶绿素的合成降低。 MDA 是膜脂过氧化的末端产物, 人们常用其含量的高低作为判断膜脂过氧化程度的重要指标。本实验中, 铜的过量胁迫使小麦叶片和根系的 MDA 相对含量明显增加, 证明了铜处理的细胞膜透性的增加确实是由于铜对细胞膜的伤害所造成。在正常情况下, 植物细胞内自由基的产生与清除处于动态平衡, 而当植物一旦处于重金属铜胁迫下, 这种平衡遭到破坏, 导致了 O 2- 、OH - 等自由基大量累积, 自由基启动膜脂过氧化作用, 膜内拟脂双分子层中含有的不饱和脂肪酸链被过氧化分解, 从而造成膜的损伤和破坏,