western blot全过程doc.doc

western blot全过程如下：1.SDS-PAGE试剂的配制（1） 30%丙烯酰胺溶液: 称取29g丙烯酰胺和1g N，N-亚甲双丙烯酰胺溶于100ml去离子水中温热,使之充分溶解,放置于棕色瓶中保存；（2）10%SDS溶液 称取SDS10g, 加入100ml蒸馏水,微热溶解；（3）10%过硫酸铵 称取0.1g过硫酸铵溶于1ml蒸馏水,临用前配制；（4）三羟甲基氨基甲烷(Tris)-甘氨酸电泳缓冲液(PH8.3):1*Tris-Gly去离子水 900mlTris碱 3.02g甘氨酸 18.8g10%SDS 10ml用去离子水补至 100ml注：一般配制成5*或10*保存（5）浓缩胶（upper gel）缓冲液(1.0mol/L PH6.8 Tris-HCl缓冲液): 称取12.11gTris,加入60ml蒸馏水,使之溶解,用HCl调至PH6.8,再加蒸馏水至总体积100ml；（6）分离胶（low gel）缓冲液(1.5mol/LPH8.8Tris-HCl缓冲液): 称取Tris18.165g先用60ml蒸馏水溶解,加入 HCl调至PH8.8,最后加水补至100ml。2. 凝胶的灌制及电泳（同时制备两块胶，一块染色一块转膜）（1）制备浓度为12%（改为15%，见附录一）的分离胶5ml(改为15ml，见附录一)去离子水 1.6ml30%丙烯酰胺溶液 2.0ml1.5mol/L PH8.8Tris-HCl缓冲液 1.3ml10%SDS 0.05ml10%过硫酸铵 0.05mlTEMED 2ul(2)速在两玻璃板间灌注丙烯酰胺溶液,预留1.5cm灌注浓缩胶, 应排除凝胶底部玻璃板间的气泡.用吸管在丙烯酰胺溶液上层轻轻覆盖双蒸水（异丙醇效果更佳）, 将凝胶置于室温（30min）；(3)分离胶聚合后倾出覆盖液体,并用滤纸吸净残留液体；(4)制备浓度为5%的浓缩胶2ml(改为6ml，见附录一)；去离子水 1.4ml30%丙烯酰胺溶液 0.33ml10mol/L PH6.8 Tris-HCl缓冲液 0.25ml10%SDS 20l10%过硫酸铵 20lTEMED 2l(5) 在已经聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶, 立即插入梳子,避免气泡产生；(6) 当浓缩胶聚合的同时,将蛋白抽提液和加样缓冲液在沸水中加热5分钟,使蛋白变性；(7) 浓缩胶聚合后小心拔出梳子,立即用去离子水洗涤加样槽,以除去未聚合的丙烯酰胺；(8) 电泳槽中加满电泳缓冲液（ph8.3的Tris-Gly）,用微量加样器向加样槽中加入样品和分子量蛋白质标准(Markers)；(9) 电泳装置与电源相连,凝胶上所加电压50V,当染料前沿进入分离胶后,把电压提至100V,继续电泳至溴酚蓝到达分离胶的底部,关闭电源。(Ca.1h40min)3.转膜（1）电泳结束前,戴上手套,裁6张滤纸和一张硝酸纤维素膜,大小应与凝胶大小吻合；（2）在一个托盘中将6张滤纸、海绵及硝酸纤维素膜浸于甲醇中泡5min，再转移至转移缓冲液中泡5min；（3）转移缓冲液的配制：甘氨酸 14.4gTris碱 3 g甲醇 200ml加双蒸水至总量为1L（4）戴上手套按以下方法安装转移装置：A在塑料夹上放置用转移缓冲液浸泡过的海绵及3张滤纸,逐张叠放,精确对齐,然后用一玻璃移液管做滚筒以挤出气泡；B把硝酸纤维素膜放在滤纸上,精确对齐,滤纸与膜间不能留有气泡；C从电泳槽上撤下放置SDS-PAGE凝胶的玻璃,把凝胶转移至去离子水中漂洗一下,然后平放于硝酸纤维素膜上并对齐,排除所有气泡；D最后3张滤纸放在凝胶上方,各层精确对齐并排除气泡。（5）将夹层物中滤膜面正对阳极,接通电源,电转移100v或350mA，1小时左右；（6）断开电源并拔下电泳槽上的插头,拆卸转移装置,逐一揭去各层.把凝胶转移至盛有考马斯亮蓝的平皿中按前述方法进行染色,以便检查蛋白质是否转移完全。4. Western blot 鉴定(1)把硝酸纤维素膜转移至含封闭液的托盘中,平放在摇床上,于室温孵育一小时或4度过夜;封闭液的配制:5%的脱脂奶粉5g, TBST100ml；或3%的BSA(2)弃去封闭液,加入1:1500的兔来源anti-flag tag一抗溶液孵育1小时；(3)用TBST洗涤滤膜5-10次,每次15分钟；(4)再加HRP标记的辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(工作浓度为1:5000)孵育1小时；(5)用TBST洗涤滤膜5-10次,每次15分钟；5.染色此步可根据需要与仪器选择染色方法（丽春红，银染等）放射自显影法(在暗室里操作)(1)将膜放在X射线摄影暗盒里（保险膜）(2)加入Pro-light HRP显色液 (Easysee Western Blot Kit中A液:B液=1;1再加2ulC液)，反应1-5min(3)覆盖一张X光胶片，铺光2s-2min（依据样品发光强度而定）(4)显影液中显影5min（5）30%醋酸终止液或水1min（6）定影液中5min（7）流水冲洗 附录1:8.5*8.5的板,10 well 1.5mm胶(2块)，选15%分离胶15ml，5%的浓缩胶6ml附录21、10*TBS配方：Nacl：80g ； Kcl：2g ；Trisbase: 30g 定容至1L用时稀释至1*TBST(TBS+0.05%的Tween-20)2、Easysee Western Blot Kit -4度保存（全式金公司）3、marker;Pagerulertm Prestained Protein Ladder4,考马斯亮蓝染液的配制（配制仪器用酒精洗干净） 染色液：考马斯亮蓝R-250 2.5g/L 甲醇：水：冰乙酸=4.5：4.5：1脱色液：同上，不加考马斯亮蓝染色：常温3h，脱色：半小时换一次脱色液，3次后过夜脱色5.封闭剂缓冲液 10mmol/L Tris-CL(PH8.0) 150mmol/L NaCL 0.05%