甾体皂苷类成分提取分离方法.doc

甾体皂苷提取分离方法甾体皂苷( steroidal saponins) 是天然产物中一类重要的化学成分,大多都具有一定的生理活性,在天然产物化学研究中日趋活跃。据不完全统计,超过90 个科的植物含有甾体皂苷,尤以单子叶植物的百合科、石蒜科、薯蓣科和龙舌兰科等植物报道最多。由于含甾体皂苷成分的动植物药有相当的疗效。所以,人们在应用和研究方面越来越广泛。例如: Dracaena draco 被用于抗腹泻和止血1 ,蒺藜用于治疗眼病、浮肿、腹胀、高血压、皮癣和气管炎2, Chlorophytummalayense 对肿瘤有潜在的细胞毒活性3, A gave americana有通便和利尿的作用4, Solanum nigrum 在中国和日本用于对各种癌症的治疗5,白首乌民间用于滋补药膳,是一种有前途的抗衰老药物6,虎眼万年青民间用于抗肿瘤7,西陵知母用于治疗烦热消渴,骨蒸劳热,肺热咳嗽等8。本文就甾体皂苷的提取分离方法做一简单综述。甾体皂苷类化合物由于连有糖残基, 一般有较强的极性, 易溶于水、甲醇、乙醇等极性溶剂, 不易溶于氯仿、乙醚等非极性溶剂。甾体皂苷不易形成结晶（苷元例外）,且有时结构相似，给分离带来一定困难。甾体皂苷提取分离基本步骤为粗提、除杂、分离。1、提取目前, 实验室最常用不同浓度的工业乙醇或甲醇提取。也有用水作为溶剂的, 如:Jianying zhang 等用80 - 85 的水从Anemarrhena asphodeloides 的根状茎中提取到六种甾体皂苷9。也可以先用氯仿、石油醚等强亲脂性溶剂处理中草药原料, 然后用乙醇为溶剂加热提取, 冷却提取液, 多数甾体皂苷由于难溶于冷乙醇而作为沉淀析出10。2、除杂方法无论是用水还是醇作为溶剂提取所得到的皂苷,多还包含许多杂质, 如无机盐、糖类、鞣质、色素等, 尚需要进一步精制。2.1 液液萃取法这是一种最普遍的皂苷除杂方法, 利用皂苷一般极性较大, 易溶于水而其中的一些杂质极性较小易溶于非极性溶剂的性质来去除一些脂溶性的杂质。一般的操作是将醇提取液减压浓缩得到的浸膏, 悬浮于水中, 依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行梯度萃取,甾体皂苷一般存在于正丁醇层, 减压回收正丁醇后得总皂苷。2.2 沉淀法在含甾体皂苷的甲醇或乙醇液中倒入大量的乙醚或丙酮, 可将皂苷类化合物沉淀出来。进一步利用过滤或离心的方法即得总皂苷, 反复利用这种沉淀法可达到初步纯化的效果。也可利用皂苷会与胆甾醇形成沉淀的特性进行初步纯化。皂苷溶于乙醇, 加胆甾醇的乙醇溶液沉淀,过滤, 沉淀干燥后置于索( soxhlex) 提取器中用苯回流, 不溶物为皂苷, 苯液浓缩后可回收胆甾醇。2.3 吉拉德(Girard) 腙法吉拉德试剂T 或P 在一定条件下, 可与含羰基的甾体皂苷元生成腙, 而与不含羰基的甾体皂苷元分离。通常先将粗甾体皂苷元溶于少量乙醇, 再加入吉拉德试剂T 或P, 并加乙酸使达10%的含量, 水浴加热或室温下放置后, 加水稀释, 加入乙醚萃取除去不含羰基的皂苷元, 在水相中加入盐酸使羰基皂苷元形成的吉拉德腙水解, 即可得原羰基皂苷元。2.4 大孔吸附树脂法大孔吸附树脂多为苯乙烯或2-甲基丙烯酸酯型, 理化性质稳定, 不溶于水、酸、碱及常用有机溶剂。根据其结构单元不同分为各种型号, 常用的如: D101型、DA- 201 型、Diaion HP- 20 型、AB- 8 型等11。舒孝顺等用大孔树脂分离菝葜总皂苷, 从HPD100、HPD300、HPD600、及D101 四种大孔树脂中筛选出HPD100 非极性树脂, 研究结果表明该树脂对于本体系中的总皂苷具有吸附快解吸较易、流体流动性能好、操作简单和周期短等优势12。在用大孔树脂获得较为精致的总皂苷后, 为进一步获得皂苷单体, 一般还需采用其他的色谱方法。3、分离方法甾体皂苷亲水性较强, 有些皂苷极性非常接近,以上述方法分离纯化, 难以获得单体化合物, 所以皂苷经过一定的纯化后, 常采用不同的色谱法分离甚至反复经过色谱法分离, 才能获得单体成分。总皂苷的分离主要是采用柱色谱技术。填料以硅胶为主,另外有葡聚糖凝胶(如Sephadex LH-20) ,烷基键合硅胶(ODS) 等。Sephadex LH-20 适合于分子量相差大的化合物的分离,ODS 对极性大的化合物分离效果较好。在柱分离模式上, 有常压色谱、中压色谱(MPLC) 和高压色谱(HPLC) 。HPLC 法用于分离高极性、大分子量及结构相似的甾体皂苷有着突出的优点。3.1 制备薄层层析法方法与薄层层析相同, 只是增加薄层吸附剂厚度来增加其载药量,与柱层析相比,分离效果更好,能用来制备较纯的皂苷,但制备量最大仍只能达到几百毫克。3.2 硅胶柱层析法硅胶柱层析是一种传统的分离方法, 目前在甾体皂苷的分离工作中仍被广泛应用。如: 陈梦菁通过多次硅胶柱层析, 从四川蜘蛛抱蛋中分离到了三种甾体皂苷13。林厚文等运用反复硅胶柱层析从中药玉竹中分离到了四个甾体皂苷14。分离时经常采用氯仿- 甲醇- 水三元溶剂体系。在氯仿- 甲醇溶剂体系中加入适量的水, 可克服皂苷类化合物进行硅胶色谱分离时产生的拖尾现象, 获得更好的分离效果。3.3 反向硅胶柱层析法近年来反向键合相得到广泛应用。使用最多的预填充反向硅胶柱主要Lichroprep Rp- 8 (Merck,60-80%甲醇洗脱)和Lobar Rp- 8(Merck,60- 80%甲醇洗脱), 常使用的反向多孔聚合物有DIAION HP- 20、KogelBG4600(以不同比例的甲醇和水洗脱)。陈昌祥等从云南大理产的蜘蛛抱蛋根茎甲醇提取物中, 先经硅胶柱层析, 再经硅胶H 柱层析, 洗脱部分经Rp- 8 反向柱层析得到两种甾体皂苷15。Toshihiro Inoue 等从Dichelostemma Multiflorum 的块茎中通过ODS 反向硅胶柱层析和硅胶柱层析得到三种新的甾体皂苷和两种已知的皂苷16。3.4 葡聚糖凝胶色谱法葡聚糖凝胶是由平均分子量一定的葡聚糖及交联剂( 如含氧氯丙烷) 以醚桥的形式互相交联聚合而成的三维空间网状结构。利用凝胶吸水后能形成凝胶粒子, 在其交联键的骨架中有许多大小的网眼, 使进入凝胶内部的分子和不能进入凝胶内部的分子进行分离。常用的凝胶有sephadexLH- 20、G- 10、G- 25 等。Robson,R.B 等从Smilax Officinalis 的根状茎中应用Sephadex LH- 20 成功得到三种甾体皂苷17。周小平等由分蘖葱头的乙醇提取物经葡聚糖凝胶和硅胶柱色谱分离得到四个甾体皂苷类化合物18。3.5 高效液相层析法(HPLC) 中压液相层析(MPLC)和低压液相层析(LPLC)采用不同的压力,调整流动相的流速,具有很好的分离效果。HPLC 在甾体皂苷的分离工作中应用得最为广泛。Mitsue Haraguchi 用硅胶柱层析、MPLC、HPLC 法从Cestrum sendtenerianum 的叶中得到了五种甾体皂苷19。董梅、吴立军等从黄山药的根茎95%乙醇提取物通过硅胶柱色谱和HPLC 分离得到三个甾体皂苷20。3.6 其它柱色谱法除硅胶柱色谱外，目前也有采用中性氧化铝、氧化镁为吸附剂，用混合溶剂洗脱，可以精制皂苷，高伟华等用氧化镁吸附杂质后，再用氧化铝-大孔树脂混合柱净化处理样品，再用硅胶柱色谱进行分离纯化，得到较纯的皂苷。3.7 结晶法Masaki Itabashi 从Furcraea foetida 的干燥叶片中用结晶法得到了一种具有生物活性的甾体皂苷21。在实验中, 通常是几种分离方法相互结合, 最终才能得到纯度较高的甾体皂苷。Mimaki,Y.等从Cordyline stricta 新鲜叶中依次经过硅胶柱层析、Diaion HP- 20、ODS 硅胶层析、分配型硅胶层析、HPLC 和TLC,最终得到了三个甾体皂苷22。Satou, tadaaki 利用硅胶柱层析、TLC、ODS 硅胶柱层析、Sephadex LH- 20、Diadion HP-20、HPLC 从Lilium martaqon 的新鲜茎中得到二种新的甾体皂苷23。3.8 膜技术膜技术使用微滤膜、超滤膜、纳滤膜来分离得到物质，具有高效、过程基本无相变、可在常温下运作及工艺简单、操作方便、投资省等优点，已成为一项新兴的用于澄清、分离和浓缩等方面的绿色节能技术。通过膜技术来分离纯化甾体，可实现常规方法不能实现的分离效果。3.9 高速逆流色谱法(HSCCC)高速逆流色谱是一种不用固态支撑体或载体的液液分离色谱和能实现连续有效分离功能的实用新型分离技术。液滴逆流层析法分离效能高，有时可将结构极其相近的成分分开，近年来广泛用于分离纯化皂苷，其主要优点是没有固体吸附剂，不存在被分离物质的不可逆吸附，因此对分离纯化微量且生理活性很强的化合物尤其是极性化合物特别有意义。结语综上所述,目前实际生产提取富集甾体皂苷类化合物采用的仍主要是煎煮、回流提取，联合利用超滤技术或大孔吸附树脂等措施纯化。近年来随着反相以及中高压色谱的普遍使用，甾体皂苷提取分离技术取得了很大的进步,这些进展促进了皂苷结构、药理、药效等方面的研究。随着现代仪器分析的不断开发,提取分离技术不断进步,甾体皂苷乃至皂苷类化合物的研究必将成为天然药物化学中更加诱人和更有潜力的领域。参考文献1 Akihito Y, Yoshihiro M , Yutaka. Steroidal saponins from Dracaena surculosa J . J Nat Prod , 2000 , 63 :1239-12432 Yi-Xin X,Hai-Sheng , Hua-Qing L , et al. Three new Saponins from Tribulus terrest ris J . Planta Med. 2000 , 66 (6) :545-5503 Sheng-Xiang Q , Xing-cong L , Yansan X, et al . Isolation and Characteriza2 tion of Cytotoxic Saponin Chloromaloside A from Chlorophytum malayense J . Planta Med , 2000 , 66 (6) :587-5904 Akihito Y, Yoshihiro M , Minpei K, et al . A new steroidal saponin from the leaves of A gave americanaJ . Planta Med , 2000 , 66 (4) :393-3965 Tsuyoshi I , Hidetsugu T , Toshihiro N. Steroidal Oligoglycosides from Solanum nigrum J . Chem. Pharm. B ull , 2000 ,48 (7) :1062-10646 张如松, 叶益萍, 刘雪莉. 白首乌甾体皂苷的体外抗肿瘤作用J . 中草药, 2000 ,31 (8) :599-6017 徐暾海, 徐雅娟, 刘大有, 等. 虎眼万年青的化学成分J . 药学学报,2000 , 35 (1) :32-368 洪永福, 张广明, 孙连娜, 等. 西陵知母中甾体皂苷的分离与鉴定J . 药学学报, 1999 ,34 (7) :518-5219 Jianying Zhang , Zhiyun Meng , Meiying Zhang ,et al.Effect of six steroidal saponins isolates from anemarrhenae rhizome on platelet aggregation and hemolysis in human blood.J . Clinica Chimica Acta, 289 (1999): 79- 88.10 Wang Yan, Kazuhiro Ohtani, Ryoji Kasai and Kazuo Yamasaki. Steroidal Saponins From Fruits of Tribulus Terresris J. Phytochemistry, 1996,42(5):1417- 1422.11 卢绪芳. 大孔吸附树脂的特点及其在皂苷分离中的应用J. 实用医技杂志, 2005, 12( 8) 上半月版:2139- 2140.12 舒孝顺. 用大孔吸附树脂分离菝契总皂苷的条件优化J. 中国中药杂志, 2005, 30( 1) : 30- 32.13 陈梦菁. 四川蜘蛛抱蛋的甾体皂苷J. 天然产物研究与开发, 1995, 7( 1) :19- 21.14 林厚文,韩公羽,廖时萱.中药玉竹有效成分研究J. 药学学报, 1994, 29( 3) : 215- 221.15 陈昌祥, 周俊. 蜘蛛抱蛋根茎中的甾体皂苷J. 云南植物研究, 1994, 16( 4) : 397- 400.16 Toshihiro Inoue,Yoshihiro Mimaki,Yutaka Sashida,et al Steroidal saponins from the Tubers of Dichelostemma Multiflorum and their inhibitory Activity on Cyclic- Amp PhosphodiesteraseJ. Phytochemistry, 1995,39(5):1103- 1110.17 Robson Roney Bernardo, Antonio Ventura Pinto and Jose Paz Parente. Steroidal saponins from smilax officinalis J. 1996,43 (2):465- 469.18 周小平, 王广树, 杨晓虹, 田丁丁. 分蘖葱头中甾体皂苷成分的分离与鉴定J. 中国药物化学杂志, 2004, 1( 2) :102- 105.19 Mitsue Haraguchi,Yoshihiro M