大鼠骨髓间充质干细胞分离鉴定方法及生物学特.doc

www.CRTER.org曹华，等. 大鼠骨髓间充质干细胞分离鉴定方法及生物学特性大鼠骨髓间充质干细胞分离鉴定方法及生物学特性曹 华1，高建华1，刘小龙1，林思思2(1江西医学高等专科学校，江西省上饶市 334000；2南昌大学医学部，江西省南昌市 330006)引用本文：曹华，高建华，刘小龙，林思思. 大鼠骨髓间充质干细胞分离鉴定方法及生物学特性J.中国组织工程研究，2017，21(9):1357-1361.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.09.009 ORCID: 0000-0002-2309-8579(曹华)文章快速阅读：大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养观察指标：细胞计数法观察细胞生长增殖能力，MTT法检测细胞存活率。结论：获得的细胞生长稳定，增殖能力强，可选用前5代细胞作为软骨组织工程的种子细胞。方法：采用全骨髓贴壁培养法体外分离培养骨髓间充质干细胞。文题释义：CD34分子：是高度糖基化的型跨膜糖蛋白，选择性地表达于人类及其他哺乳动物造血干/祖细胞表面，并随细胞的成熟逐渐减弱至消失。目前已有愈来愈多的研究结果表明CD34分子在介导细胞间黏附作用中发挥着重要作用，可以参与造血干细胞的运输、定植，参与炎症反应以及淋巴细胞的归巢。CD44分子：参与细胞-细胞、细胞-基质间的相互作用，主要参与异质性黏附，在调控细胞生长、生存、分化和迁移中发挥重要作用，同时作为受体协同分子，CD44还可以与多种分子，包括细胞外基质、生长因子、基质金属蛋白酶等相互作用，参与肿瘤细胞增殖、迁移等的调控。摘要背景：如何能简便高效地获得均质性的骨髓间充质干细胞群是软骨组织工程研究的重点。目的：分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，观察其生物学特性。方法：抽取30只SD大鼠股骨以及胫骨骨髓，采用全骨髓贴壁培养法体外分离培养骨髓间充质干细胞，流式细胞仪测定细胞表面标记物的表达，细胞计数法观察细胞生长增殖能力，MTT法检测细胞存活率。结果与结论：刚分离培养的细胞呈圆形、椭圆形，部分细胞呈三角形，接种12-15 d后，细胞开始融合，传代后细胞增殖速度加快，传代2 h后细胞均匀分布在瓶底；随着传代次数的增加，细胞增殖能力出现下降趋势，第1-5代细胞存活率均超过95%，显著高于第6代和第7代(P 0.05)；骨髓间充质干细胞表面CD34呈阴性表达，CD44呈阳性表达；结果表明，采用全骨髓贴壁法可有效分离大鼠骨髓间充质干细胞，获得的细胞生长稳定，增殖能力强，可选用前5代细胞作为软骨组织工程的种子细胞。关键词：干细胞；骨髓干细胞；骨髓间充质干细胞；全骨髓贴壁培养；生物学特性；流式细胞仪；标记物；增殖能力主题词：骨髓；间质干细胞；细胞增殖；组织工程Isolation, identification and biological characteristics of rat bone marrow mesenchymal stem cells Cao Hua1, Gao Jian-hua1, Liu Xiao-long1, Lin Si-si2 (1Jiangxi Medical College, Shangrao 334000, Jiangxi Province, China; 2Medical School of Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China)曹华，女，1978年生，江西省上饶市人，2013年皖南医学院毕业，硕士，讲师，主要从事医学生物化学方面的研究。 中图分类号:R394.2文献标识码:A文章编号:2095-4344(2017)09-01357-05稿件接受：2016-11-18Cao Hua, Master, Lecturer, Jiangxi Medical College, Shangrao 334000, Jiangxi Province, ChinaAbstractBACKGROUND: How to effectively harvest bone marrow mesenchymal stem cells with homogeneity is crucial for cartilage tissue engineering research. OBJECTIVE: To isolate and culture rat bone marrow mesenchymal stem cells and to observe biological characteristics of the cells. METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells were isolated from the femur and tibia of 30 Sprague-Dawley rats using the whole bone marrow adhesion method. Cell surface markers were identified using flow cytometry, cell proliferation ability was observed through cell counting, and cell survival rate was determined by MTT assay. RESULTS AND CONCLUSION: The harvested cells were mostly round and oval, which partially showed a triangular shape. Cell fusion appeared after 12-15 days of inoculation. The proliferation of passaged cells was accelerated. Two hours after passage, the cells evenly covered the bottom of the culture dish. With the increasing of cell generations, the cell proliferation ability was gradually decreased. The survival rates of cells at passages 1-5 were 3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 over 95%, significantly higher than those at passages 6 and 7 (P 0.05). The harvested cells were negative for CD34, but positive for CD44. To conclude, the whole bone marrow adhesion method is effective to isolate rat bone marrow mesenchymal stem cells with stable growth and strong proliferation ability. Passage 5 cells can be selected as seed cells for cartilage tissue engineering. Subject headings: Bone Marrow; Mesenchymal Stem Cells; Cell Proliferation; Tissue EngineeringCite this article: Cao H, Gao JH, Liu XL, Lin SS. Isolation, identification and biological characteristics of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2017;21(9):1357-1361.1359ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction关节软骨缺损是临床上发病率较高的疾病，其致病原因相对较多，如创伤、肿瘤、骨性关节炎等，由于软骨面位置特殊，再生能力较差，导致其缺损后难以自我修复，严重者甚至引起关节功能丧失，给患者生活、工作等带来很大不便。目前，关节软骨缺损治疗方法较多，如手术治疗、药物治疗等，但是治疗周期较长，对患者创伤较大1。近年来，随着医疗技术的飞速发展，为关节软骨缺损修复提供了新的思路和方法2-3。干细胞是一类比较特殊的细胞，该类细胞具有自我更新能力和多向分化潜能而在临床上研究较多4。骨髓间充质干细胞具有极强的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的条件下能分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等5-12。骨髓间充质干细胞取材相对比较方便，对自体创伤较小13-14。骨髓间充质干细胞更加有利于外源基因转染以及表达调控等15。目前，骨髓间充质干细胞已经成为软骨组织中首选的种子细胞，能够为关节损伤等提供新的治疗方法16-18。实验分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞，对纯化的细胞进行形态学观察，并检测其生物学特性。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 细胞学观察实验。1.2 时间及地点 于2013年10月至2015年10月在广西医科大学第一附属医院完成。1.3 材料 健康SD大鼠30只，3-6个月龄，雌雄随机，SPF级，体质量为0.13-0.35 kg，平均(0.340.02) kg，由广西医科大学第一附属医院动物实验中心提供，严格遵守相关标准饲养。对SD大鼠的处理符合关于善待实验动物的指导性意见中相关规则19-20。1.4 实验方法1.4.1 骨髓间充质干细胞分离、培养 取30只SD大鼠，给予2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后处死，体积分数为75%乙醇浸泡10 min，在无菌条件下取出股骨以及胫骨，PBS冲洗3次21-22，用含有青霉素-链霉素的L-DMEM培养基进行反复吹打，制备骨髓单细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，去除上层清液，以细胞浓度为1109 L-1接种于25 cm2培养瓶，放入培养箱中进行培养23。培养3 d后进行全量换液，待细胞贴壁融合80%左右时进行传代培养，每2 d换液1次，在倒置显微镜下观察细胞生长情况24-25。1.4.2 骨髓间充质干细胞鉴定 利用流式细胞分析仪检测骨髓间充质干细胞表面标记物的表达，取第3代骨髓间充质干细胞，吹打成单细胞悬液，移入10 mL离心管中，1 000 r/min离心5 min，去除上清液，PBS重悬，重复离心，连续洗涤3次，调整细胞浓度为2109 L-1，200目筛网过滤，备用，取流式细胞仪专用试管4个，每管加入100 L细胞悬液，加入荧光抗体CD44-APC小鼠抗人单克隆抗体、CD34-PE小鼠抗人单克隆抗体及同型对照抗体各5 L，孵育15 min，采用流式细胞仪进行测定26-27。1.4.3 骨髓间充质干细胞增殖能力 观察第1代、第3代、第5代以及第7代骨髓间充质干细胞在培养第1，2，3，4天时的生长情况28-29。1.4.4 骨髓间充质干细胞活力测定30-31 采用MTT法检测第1-7代骨髓间充质干细胞活力。将细胞浓度为1108 L-1的骨髓间充质干细胞接种于96孔培养板中，加20 L 5 g/L MTT培养4 h，小心吸弃全部上清液，并加入150 L二甲基亚砜，充分振荡、溶解，采用酶联检测仪在570 nm波长下测定细胞吸光度，计算存活率，重复测定3次，取平均值。1.5 主要观察指标 骨髓间充质干细胞形态；骨髓间充质干细胞表面标记物的表达；骨髓间充质干细胞的增殖能力；骨髓间充质干细胞存活率。1.6 统计学分析 采用SPSS 18.0软件处理数据，计量资料采用s表示，行t 检验，P 0.05为差异有显著性意义。2 结果 Results 2.1 原代细胞形态 原代培养第1次换液可见细胞贴壁生长，多数细胞呈圆形、椭圆形，部分细胞呈三角形，接种 4 d后细胞开始出现分裂(图1A)；接种12-15 d后细胞集落开始融合，并且细胞单层生长铺满培养皿底(图1B)。2.2 传代细胞形态 传代后，细胞悬浮在培养液中，呈现“满天星”分布(图2A)，传代2 h后细胞均匀分布在瓶底，且细胞呈三角形、多角形，部分细胞开始演变为梭形，细胞分布均匀(图2B)。2.3 大鼠骨髓间充质干细胞表面标记物表达 经流式细胞仪分析显示：第3代骨髓间充质干细胞表面标志物CD44表达率为99.7%，呈强阳性，CD34表达率为1.5%，呈阴性，见图3。2.4 骨髓间充质干细胞生长增殖情况 随着传代次数的不断增加，细胞增殖能力出现下降趋势，每次传代经过2- 5 d对数增殖期然后进入平台期，见图4。2.5 各代骨髓间充质干细胞活力 前5代骨髓间充质干细胞成活率均超过95%，显著高于第6代(88%)和第7代(85.25%)，差异有显著性意义(P 0.05)，见图5。 AB876543210细胞数(104 L-1)第1天 第2天 第3天 第4天图4 各代骨髓间充质干细胞生长增殖情况Figure 4 Proliferation of rat bone marrow mesenchymal stem cells at different passages第1代 第3代第5代 第7代图1 原代SD大鼠骨髓间充质干细胞形态(200)Figure 1 Morphology of primary bone marrow mesenchymal stem cells from Sprague-Dawley rats (200)图注：图中A为原代细胞接种4 d，细胞开始出现分裂；B为原代细胞接种12-15 d，细胞集落开始融合，并且细胞单层生长铺满培养皿底。 AB1051009590858075细胞存活率(%)图2 传代SD大鼠骨髓间充质干细胞形态(200)Figure 2 Morphology of passaged bone marrow mesenchymal stem cells from Sprague-Dawley rats (200)图注：图中A可见传代细胞呈“满天星“分布；B为传代细胞呈三角形、梭形。第1代 第2代 第3代 第4代 第5代 第6代 第7代图5 各代骨髓间充质干细胞活力Figure 5 Cell viability of rat bone marrow mesenchymal stem cells at different passages图3 大鼠骨髓间充质干细胞表面标记物表达Figure 3 Surface marker determination of rat bone marrow mesenchymal stem cells 图注：图中A为骨髓间充质干细胞表面标记物CD34呈阴性表达；B为骨髓间充质干细胞表面标记物CD44呈阳性表达。3 讨论 Discussion关节软骨缺损是临床上常见的疾病，手术治疗虽然能够提高临床疗效，但是患者容易产生二次创伤，治疗预后较差32。近年来，软骨组织工程得到飞速发展，但是由于各种因素限制等，该治疗方法难以在基层推广应用。另外，关节软骨缺损患者选择该方法治疗时由于缺乏理想的种子细胞，也使得其应用受到很大限制。自体软骨细胞是目前最为理想的细胞，但是细胞数量有限，长期体外培养容易引起细胞老化，严重者甚至出现细胞生物功能退变，丧失分化能力。异体软骨细胞移植时又会产生免疫排斥问题，导致修复效果不理想33。骨髓间充质干细胞是一类比较特殊的细胞，该细胞能够在微环境信号的指令下分化为成骨细胞以及软骨细胞，在软骨下骨损伤修复中能够取得理想的效果。由于关节腔内环境相对特殊，机体内的各种细胞因子等能促进骨髓间充质干细胞在特定条件下向软骨细胞分化，从而形成软骨组织34-45。由此看出：骨髓间充质干细胞是软骨组织中比较合适的种子细胞46-47。目前，骨髓间充质干细胞的分离方法主要有密度梯度离心法、贴壁细胞分离法、流式细胞仪等，这些方法各有优缺点48。贴壁细胞分离法即根据干细胞在低血清培养基中有贴壁优势特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化及扩增间充质干细胞的目的。密度梯度离心法即根据骨髓中各细胞成分密度的不同，分离单核细胞进行贴壁培养。二者本质上无多大区别。随着对间充质干细胞表面抗原认识的深入，又有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化。但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之成本较高和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。鉴于实验条件，实验采用全骨髓贴壁细胞分离法对骨髓间充质干细胞进行培养。该方法操作相对简单、快速、实用，是一种比较理想的分离、纯化方法。研究表明，骨髓间充质干细胞表面有多种抗原，如CD34、CD44等。CD34在骨髓成纤维细胞、造血干细胞中表达较多，CD44属于细胞黏附分子，为多功能透明质酸受体，具有透明质酸、胶原蛋白、纤维黏连蛋白等细胞外基质的结合位点，通过其胞质内区域丝氨酸和苏氨酸的磷酸化和去磷酸化，CD44与细胞骨架蛋白相互作用，使骨髓间充质干细胞和细胞外基质蛋白结合。骨髓间充质干细胞通过表达CD44介导细胞间、细胞与细胞外基质间的相互作用，影响自身的生长、增殖和分化，在骨髓微环境中起重要作用。流式细胞仪检测结果显示CD34呈阴性表达，CD44呈阳性表达，由此看出骨髓间充质干细胞是一种不同于造血干细胞的间充质干细胞。综上所述，实验建立起了体外分离培养骨髓间充质干细胞的方法，初步了解了间充质干细胞的一些生物学特性，为应用骨髓间充质干细胞作为种子细胞，通过组织工程方法修复关节软骨缺损提供了实验基础。作者贡献：实验设计、实施、评估为所有作者。利益冲突：所有作者共同认可文章无相关利益冲突。伦理问题：实验过程中对动物的处置符合2009 年Ethical issues in animal experimentation相关动物伦理学标准的条例。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。作者声明：第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。开放获取声明：这是一篇开放获取文章，文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。根据知识共享许可协议“署名-非商业性使用-相同方式共享3.0”条款，在合理引用的情况下，允许他人以非商业性目的基于原文内容编辑、调整和扩展，同时允许任何用户阅读、下载、拷贝、传递、打印、检索、超级链接该文献，并为之建立索引，用作软件的输入数据或其它任何合法用途。4 参考文献 References1 江凌勇,赵志河,王军.张应力对成骨分化骨髓间充质干细胞ODF mRNA 表达的影响J.医用生物力学,2010,25(6): 428-432.2 Sauerzweig S, Baldauf K, Braun H, et al. 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