外源菌在植物根际的定殖及在净化污染土壤中的作用.doc

外源菌在植物根际的定殖及在净化污染土壤中的作用季淼张甲耀*陈玲陈效摘要:介绍了一种新的生物强化技术,即植物根系与外源高效降解微生物构成的复合降解系统。讨论了在构建这一系统中的外源微生物在根际定殖的机理、机制、方法，以及在净化污染土壤中的作用。指出了目前存在的问题和今后的发展方向。关键词：外源菌植物根际定殖污染土壤复合降解系统净化1引言植物根际是土壤中受植物根系及其生长活动影响的微域环境，由于植物根系分泌物的存在，从而有着特殊的物理和化学性质，同时根际的微生物活动和生物量与无根系的土壤也有很大的区别。微生物在根际区与无根系土壤中的数量差一般为520倍，有的高达100倍。这种微生物在数量和活动上的增长，很可能是使根际非生物化合物代谢降解的因素1。根系特定的分泌物可以影响植物对土壤介质中养分的吸收，有研究表明，根际环境中由于根系分泌物的作用，致使重金属在根际中的含量和分布出现差异2。Cacador3发现，不论在哪个采样点的Zn、Pb、Cu，在根际沉积物中的含量都要大于非根际沉积物，而Cr、Ni则出现相反的情况，非根际沉积物中的含量要高一些。根系独特的物理、化学与生物性质，使得根际环境的研究，在促进植物生理功能发挥及其对土壤污染的净化作用方面，有极其重要的作用。一直以来，对污染土壤的治理多用生物修复方法，但随着工农业发展，污染物的种类越来越多，降解程度越来越难。这向原有的处理设施和技术提出了挑战。生物强化技术（Bioaugmentation）是指在生物处理体系中投加具有特定功能的微生物来改善原有处理体系的处理效果，充分发挥微生物的潜力4。利用根际的特殊的理化性质，将经过改造的高效降解微生物定殖于根际，构成一种新型复合净化系统，是目前生物强化技术发展的一个新方向。2植物根际的根系与微生物构成的复合系统在根际环境中，植物的根系为根际的微生物提供了生态位和适宜的营养条件，以保证微生物的数目和活性的维持，而微生物的活动还可以修饰和降解土壤中的污染物，有利于根系在土壤中的存活和扩展57。根系与微生物互惠互利的明显例子，就是固氮菌与豆科植物。有研究表明，有固氮菌的豆科植物，根际微生物的生物量、植物的生物量和根际分泌物都有所增加。利用根际环境的此种特性，可以通过由生物工程方法得到的高效降解菌定殖于植物的根际，此种高效降解菌可以是一种多种或者是菌群810，从而构建出针对某一种或几种污染物有高效净化作用的植物根系微生物复合系统11，12。3外源微生物在植物根部定殖的研究外源微生物是通过实验室驯化、修饰,提高其降解能力或带有某种特性后，再施用于污染土壤的细菌、放线菌、真菌等一系列微生物的统称，其相对于土壤的土著微生物而言是外来的微生物。微生物对有机污染物适应性的遗传机制研究表明,微生物为了在污染地区环境中生存,微生物之间可以发生水平基因转移或在细菌的染色体内进行基因重排、突变、复制，以形成能够降解有机污染物的优势菌,从而充分利用污染物作为其生长基质或形成共代谢13。然而，由于各种环境条件和生物因子的限制,微生物的自然进化过程相当缓慢,且没有一定的方向。利用基因工程技术从遗传物质着手改造，驯化已有的微生物，得到遗传修饰微生物（GeneticallyModifiedMicroorganisms，GMMs）或基因工程微生物（GeneticallyEngineeredMicroorganisms，GEMs）。常用的技术有:质粒转移、DNA重组、基因诱变和原生质体融合14。实际应用中，由于环境因子的复杂性和土著微生物的作用.问题主要集中在高效菌的存活、繁殖，降解活性的保持和生态安全,细菌-植物根系系统和基因工程菌的结合等15。将构建好的高效降解菌定殖于植物的根际,使之能够存活、繁殖，并且生长成为优势菌群，这是基因工程菌应用的关键。根部定殖是一种引入菌株在植物根部（包括外根圈,也包括根面或内根圈）定居繁殖的过程,而不只是简单引入菌株与植物根部被动相遇的过程,而且根部定殖是发生在有土著微生物参与竞争的情况下。现在一般认为，根部定殖是指在有土著微生物存在的情况下,接种到种子或植物无性繁殖体部分，并在根部繁殖及保持其种群的能力16。目前，农业研究中已有将各种有益微生物（如生防菌11BCA；根围粗生菌PGPR,YZB)定殖于农作物根部的研究17。31根部定殖的机理关于微生物在植物根部的定殖过程,曾经有人提出一种“双相”模式18:（1）散布相(Dispersalphase)。根尖露出种皮带动引入细菌被动传送,植物的根在此时生长比较快,引入细菌开始繁殖时，有一些细菌滞留在根尖后面,或随根冠细胞脱落成为较老根段部位的接种源,这就使得引入细菌随根的生长而沿根散布沉积。（2）增殖相(Proliferationphase)。紧接着散布相沿根散布沉积下来的细菌，会在营养丰富的根圈生态位增殖并形成微菌落,但只有那些对土著菌有竞争优势的菌株方能增殖。然而，实际环境中这两相实际上没有严格的限制,往往会同时发生在根的不同部位。32根部定殖的机制20世纪70年代中期,Bowen&Rovira19提出以下4种可能:（1）微生物的运动性(Motility)。引入微生物自身的运动能力，使微生物在根部传播,Scher&Kloepper20及Lawrence21等均发现，运动性的细菌较其不运动的突变株有较大的沿根散布能力，不过此机制在根圈定殖中的地位，目前仍未得到充分肯定。（2）生长根带动细菌分布的作用(Bacterialdistributionbythegrowingroot)。引入微生物在根的生长过程中，因根的生长而被动被根携带、散布、沿根沉积。这一观点受到Bowers&Parke22的挑战,他们发现即使在较低的温度(16)下豌豆根生长极慢时,荧光假单孢菌PRArif也不能散布到种子下方3cm远的根段部位。（3）向下水流的作用(Bydownwardflowofwater)。沿根向下的水流(例如渗透水、灌溉水)对引入微生物分布到新的根段部位起到重要的作用23，24。Boelens等25的研究进一步表明，水分灌溉与接种方式一样都是决定荧光假单孢菌ANP15能否在根系内良好分布的主要因素。（4）转运作用(Translocation)。植物根系内真菌菌丝上粘付的微生物，会随菌丝的伸长和菌丝的转运作用沿根分布。在某种程度上而言，与根共生真菌的菌丝就是根的延伸，而且由于真菌的作用，这些微生物在其散布过程中或许不会受到其他微生物的竞争26。针对微生物在根部定殖的可能性，大量的研究结果表明，不同的菌株在不同植物和土壤条件下沿根散布的机制不同,不一定是某一机制由始至终起决定作用。微生物的被动传送（根尖、菌丝的传送，及随渗漏水的转移）和本身的运动性，对于它们的散布都有影响。每一种因素的相对作用可能受到包括根的生长速率、运动性、趋化性和细胞表面性质等因素的影响,而且微生物在根系上的分布本来就是不均匀的26。33影响根部定殖的主要因素3.3.1土壤环境有研究表明17，细菌在质地较轻(粗)的土壤中，运动距离要比在质地较重(细)土壤中的大,其根部定殖水平也较高。在孔隙大小分布不同的粉砂和壤土砂粒中引入荧光假单孢菌，接种3a内的监测结果表明，粉砂壤土中的下降趋势较为缓慢27。当土壤水含量较高时,水分充满大量土壤空隙导致氧气量不足,细菌的运动性,细胞的张力和养分的扩散性则会下降。但是土壤中的渗透水对引入细菌的长距离传送也有重要作用。总之,土壤水分含量主要影响细菌根部定殖的群体水平,而灌溉方式主要影响细菌沿根的分布28。土壤温度一方面可以影响植物的生长和发育,改变根分泌物的量,进而影响微生物在根部的定殖；另一方面也会对外源微生物与土著微生物的竞争、生长产生直接的影响。例如,土壤的温度一般相对较低(3.3.2生物因素土著微生物的颉抗作用和竞争作用,是决定引入细菌能否在根圈成功定殖的主要因素,同时土壤原生动物的捕食作用30及噬菌体引起的细胞裂解31，也会使外来菌的定殖趋势下降。Sinclair和Alexander32曾提出，当细菌被原生动物捕食时，生长较慢的细菌种群数量下降较快，而生长较快的细菌种群数量下降不明显或较慢，这与细菌繁殖的补偿作用有关。此外，引入微生物的性状(例如细胞表皮性质、渗透压、耐受性、生长速率等)和微生物的生理学特征（如营养型或营养要求）对微生物的定殖也有影响。植物根系渗出物或分泌物的类型和数量，也是影响微生物定殖的不可忽视的因素33。有研究表明，植物的健康状态与携带的微生物区系关系十分密切，同时也证实了植物基因型对其所具有的微生物群落的种群密度、组成、微生物的种类均有影响34。此外植物的种类、品种、生长期也是要考虑的因素。3.4定殖及其检测方法目前农业上多采用菌液浸泡种子萌发后，种入土壤定殖的方法。但这种方法并不适合于污染土壤的生物治理，因为植物的生长周期长,且在幼苗时期对污染物的抵抗力和降解力弱,在污染严重的地区难以存活。因而，在污染治理中应尽可能利用原污染地已有的植物作为根系的提供者,在已经长成的植物根系上接种高效降解菌,根据定殖的机制可尝试使用根部定点注射或含菌水灌溉的方法。对于根际定殖微生物的检测，是根际微生物复合系统应用中重要的一步。由于微生物的微观性和土壤中微生物系统的复杂性，目前对外源微生物多采用在定殖前进行标记，而天然抗生素标记和外来基因标记，是常用的标记方法。王平等35利用发光酶基因标记华癸根瘤菌JS5A16L，研究其在紫云英根圈的定殖动态。吕泽勋等36则利用绿色荧光蛋白基因(gfp)，标记产酸克雷伯氏菌SG-11，研究其在水稻苗期根部的定殖。DNA和RNA探针法，免疫学方法也可以利用37。4根际定殖的微生物系统的生态功能及其在净化污染土壤中的作用根际微生物对植物的影响作用主要有：（1）提高植物对重金属的抵抗力。微生物不能降解重金属，但是某一些微生物在较高浓度的重金属污染环境中仍然能够生存，表现出一定的耐受性，也就是说微生物也具有对重金属的抗性和解毒机制。根际微生物可以通过改变土壤溶液的pH，产生H2S、铁载体和各种有机物，来影响重金属的化学行为，其细胞壁及粘液层可直接吸收固定重金属，或通过分解代谢重新把污染物释放到环境中去38。此外，根际微生物也可通过改善土壤的团粒结构，改变根际环境的理化性质和根系分泌的组成等，间接地作用于重金属的迁移转化过程38。（2）提高植物对大分子有机物污染的净化能力。土壤微生物本身能降解PAHs。在植物存在的条件下，其降解能力可提高2%4.7%，特定降解菌的投入可以不同程度地提高土壤PAHs总量的降解率，尤其对蒽、芘和苯的降解有明显的促进作用39。Sapir等32发现，在受到除草剂莠去津（Atrazine）污染的土壤中，投加假单孢菌进行生物强化，可使莠去津的矿化率由1%提高到90%100%。而Erickon等40的研究表明，运用植物和微生物共同组成的生态系统可有效去除土壤中的PAHs、三氯乙烯等有机污染物。Sandmann1也指出，许多植物根际区的农药降解速度快，降解率与根际微生物数量的增加成正相关，且多数微生物联合的群落比单一的微生物群落对化合物降解有更广泛的适应范围。（3）提高豆科植物的固氮效率。张磊等41发现，在盆栽条件下施用专性小麦根际联合固氮菌，可提高根际土固氮酶的活性、植株叶绿素、全氮含量及小麦的生物量。事实上，大多数根际微生物本身并不能固氮，但可以促进根瘤固氮，从而提高固氮效率。有实验表明42，在绿豆根部接种根瘤菌，又接种一种叫VA的菌根真菌，由于菌根的作用，根瘤菌的固氮性比单一接种根瘤菌提高5.8倍。（4）增强植物的抗旱能力，促进植物对无机养分的吸收，促进植被恢复42。实验表明根际微生物在提高植物的抗旱能力、节约用水方面的作用不可轻视。例如，接种有VA菌根的柑橘幼苗，遇到天旱不易凋萎，即使凋萎了也能很快恢复。有研究表明42，根际微生物可以促进植物对土壤中磷的吸收，使得土壤中的含磷量即使小于最低含磷量，植物也能正常生长。除磷外，根际微生物还能提高植物对锌、铜、硫、铁等元素的吸收。根际定殖的微生物系统在污染土壤的处理中具有很大的潜力。Kreslavski等43通过研究发现，2，4，6-三硝基甲苯（TNT）在根际土壤中的降解速度要高于无根系的对照土壤，其主要分解产物二硝基氨基甲苯（ADNT）在土壤中的积聚和降解速率也大于无根系的对照土壤。Miya与Fiestone44的研究表明，在含有菲的土壤中，根际区的微生物量较无根系区高3倍，在植物生长24d后，菲的降解率要远高于无植物生长的土壤。同时还有研究指出45，根系与定殖的微生物构成的复合系统，可以提高土壤中的石油烃的降解