发展与抗病相关的分子标记genesin菜豆基于全基因组序列.doc

发展与抗病性相关的分子标记genesin菜豆基于全基因组序列摘要菜豆(菜豆)是最重要的谷物豆类供人类直接消费在世界中,特别是在发展中国家构成蛋白质的主要来源。Unfortu-nately、刀豆产量稳定性受到害虫和疾病。resistantgenotypes的使用是最经济和生态安全意味着控制植物病害,已经努力描述基因抗性基因在菜豆(R基因)。尽管它农学 importance,基因组菜豆中可用的资源是有限的,直到最近sequencingof菜豆基因组(安第斯基因型G19833)。除了允许注释NucleotideBinding-Leucine丰富重复(NB-LRR)编码基因家族,疾病的流行类Rgenes在植物、访问的整个基因组序列菜豆可以很大的帮助intenseselection增加作物的整体效率改进程序使用分子标记辅助区(MAS)。本文介绍了常见的艺术状态bean NB-LRR基因簇,在subtelomeres peculiarlocation和相关基因单基因R基因特征,以及演出整个基因组序列的可用性可以提高分子标记简称forMAS的发展IntroductionCommon bean(菜豆)是世界上最重要的foodlegume尤其是ascentral等发展中国家和南美洲和非洲东南部。在这些国家,刀豆代表蛋白质的饮食的一个重要来源,因此com-bat营养不良的一个关键组成部分数亿小农(/)。此外,有许多健康bene-fits吃豆类包括降低血液胆固醇”水平进而减轻某些类型的癌症,type2糖尿病和心血管疾病1。尽管agronomicimportance,基因组中可用的资源菜豆werelimited直到最近。因此,常见的bean是统称“孤儿作物”,对应于庄稼不exten-sively交易和研究人员相比,所谓的“主要”作物如玉米、水稻和小麦2。然而,最近完整的植物基因组测序已经成为下一代sequenc-ing increasinglymore常规出现以来(上天)技术3。常见的bean是一个自花受精的二倍体(2 n = 2 x = 22)物种基因组相对较小587 Mb。Inthat背景下,整个基因组的菜豆最近beensequenced4。限制大豆生产的主要问题之一是diseasessuch bean生锈(Uromyces appendiculatus)5,角叶斑病(Pseudocercospora griseola)6,白粉病(白粉菌属diffusa)7或光环枯萎病(两)5。炭疽病,相关专业hemibiotrophic刺盘孢属真菌linde-muthianum,是常见的最重要的疾病之一beanthroughout世界8。感染疾病暴发一般originatefrom污染种子或植物碎片(9、10)。Becausechemical控制是昂贵的和代pathogen-freeseeds往往是困难的在发展中国家,基因resistancerepresents最可靠的控制策略8。使用resistantgenotypes managementstrategy是最经济和生态安全。对炭疽病抗性育种主要focusedon单基因显性抗性基因后gene-for-gene模型11。几个主要炭疽病抗性基因(R基因),称为基因被描述图1所示。物理图谱的11个菜豆pseudomolecules个人主办和TNLs khipu卫星,和近似位置的基因characterizedmonogenic抗病基因。376 NL编码基因的相对位置地图显示在个人pseudomolecules描绘中标识的染色体Pv01-Pv114。每个基因都有能标签代表去年的7位数的注释。例如,G002600位于pseudomolecule Phvul.003G002600 3对应的基因。积极的DNA链基因编码的描述在右边的染色体,而负链编码的左边所示。TNL sequencesare在粉色字体和CNL序列是在黑色字体。NLs对应伪基因都用星号(*)在他们的名字。与粉红色酒吧Khipu sequencesare表示pseudomolecule结构与块大小根据38与Khipu单位的数量成正比。着丝粒位置上individualpseudomolecules被确定使用着丝粒卫星重复识别37表示,浅灰色pseudomolecules酒吧。Pseudomolecules Pv05、Pv07 Pv08,Pv11比连杆组在同一方向(LG)B5,B7、B8,B11,分别在Pseudomolecules Pv01,Pv02,Pv03,Pv04,Pv06,Pv09,andPv10相反方向相对于LG B1-B4,B6,B9,和B10分别根据基因地图(86,87)。定位R基因物理图谱,可用链接标记的序列被用作查询BLASTN分析对G19833基因组(/pz/portal.html)。近似locationsof单基因抗病基因是由灰色区域表示连接彩色泡沫(R基因)候选人pseudomolecules位置。公司是炭疽病(刺盘孢属lindemuthianum)抗病位点885、12 - 14、16 - 19日。安第斯和中美洲炭疽病抗性基因座是由蓝色和蓝绿色的泡沫,分别。你生锈(Uromyces appendiculatus)抗病位点(Ur-Dorado Ur-Ouro黑人,Ur-BAC 6参考线源的不知名的基因)5,89,Phg angularleaf现货(Pseudocercospora griseola)抗病位点(16岁,46),下午白粉病(白粉菌属diffusa)抗病位点48和Pse Rpsar光环枯萎病(两)抗病位点(43岁,47)。我是抵抗轨迹BCMNV普通花叶坏死病毒(Bean),BCMV(Bean普通花叶病毒),ZYMV(西葫芦黄花叶病毒),BSMV(Bean严重花叶病毒),PWVK(有木质virus-K),对WMV(西瓜花叶病毒2)CabMV(豇豆aphid-borne花叶病毒),ThPV(泰国passifloramosaic病毒)和SMV(大豆花叶病毒)49岁、50、65、90 - 92年)。Bct是抵抗质疑的轨迹(甜菜大前病毒)5,2是一个R基因抵抗BYMV(Beanyellow花叶病毒)和CLYVV(苜蓿黄脉病毒)52,PvCMR1 R基因(TNL)抗巨细胞病毒(黄瓜花叶病毒)定位使用specificPCR引物序列作为查询BLASTN分析对G19833基因组(/pz/portal.html)93。R-BPMV是抵抗BPMV的R基因(Bean podmottle病毒)51和bc隐性基因BCMNV阻力和BCMV94 - 94。菜豆(5、19)。然而,这些特定的使用R geneshas没有提供持久的阻力,尤其是在拉丁Amer-ica菜豆起源领域20。解释为特定的R基因的快速分解依赖于extensivepathogenic多样性显示c . lindemuthianum evidencedby众多种族中描述文学(8、15、21)。一个应对sin-gle赋予的短期保护基因,是金字塔特定R基因植入一种植物(22、23)。即使金字塔的机制(s)增加durabilityare不清楚,标准的教条已”,probabilityof无性繁殖的病原体变异对所有毒性R genesin金字塔将单独eachgene概率的乘积,因此,让毒性pathotypearising极不可能的概率”24。最好的记录suc-cess故事基于这一策略的控制杆和小麦leafrusts24。事实上,直到锈病raceUg99最近发现,耐药基因通过控股公司已成功控制小麦stemrust自1950年代中期以来25。对于interac-tion p .寻常的/ C。lindemuthianum,安第斯andMesoamerican R基因的组合,提出了以实现对炭疽病durableresistance5。事实上,适应的c . lin-demuthianum株植物同源观察inwild刀豆的数量增长的中心diver-sity p的寻常的以及驯化bean15。然而,将多个R基因整合到单个育种行isa困难,时间和相应的任务,因为epistaticinteractions R基因需要testcrossing和progenytesting不同菌株之间的病原体。成金字塔形状的基因在单一的品种,作为持久抗性的策略,可以通过分子标记辅助选择(MAS)greatlyfacilitated26。发展的分子标记最近得益于NGS-based正成功地用于新创全基因组shotgunsequencing参考基因型和全基因组resequenc-ing。MAS有着巨大的潜力和代表一个伟大challengeof分子育种在21世纪(途径)。在分子水平上,大多数克隆R基因编码intracellularproteins包含nucleotide-binding(NB)网站和C-terminalleucine rich-repeat(远程雷达)域(29、30)。R基因属于学已确定在不同的植物物种,在monocotsas在双子叶植物,和对应于R基因有效againstall类型的病原体和害虫,包括真菌、细菌、病毒、线虫、卵菌纲和昆虫。NB-LRR(NL)可分为两个子类的基础上他们的伴序列,对应两个古老血统31:那些编码n端结构域与人数/ Interleukin-1受体同源性(TIR-NB-LRR或TNL),和那些编码n端coiled-coilmotif(CC-NB-LRR或补偿中子测井)29。NB-LRR可以编码蛋白质的基因plantsand家庭最大和最变量通常是在复杂的集群组织基因紧密相连(32、33)。在目前的审查,利用整个genomesequence刀豆,我们将分配ofNB-LRR豆基因组中基因,他们潜在的协同定位withgenetically阻力对variouspathogens特异性特征以及繁殖的阻力、特别是foranthracnose可以受益于刀豆的全基因组序列的可用性。2。基因和基因组的分布monogenicresistance genome2.1基因共同bean。全基因组序列的菜豆:ancientorphan作物加入现代eraG19833安第斯菜豆基因型的国际热带农业中心(国际热带农业中心),测序桑格的使用组合,454年,Illumina公司HiSeq2000读取。Agenetic地图基于7015个SNP标记被用来组装thereference基因组序列4。总共有473 Mb的587 - mbgenome组装,和98%的这个序列是genet-ically锚定在11 chromosome-scale pseudomolecules。Theassembled基因组序列注释使用transcriptomedata和从头开始的方法,允许识别的27197个蛋白编码基因座,其中包括27197替代文本。在addi-tion,重复序列也被确定。以前曾有报道称,事实上,commonbean基因组包含大量大量的重复序列34与其他豆类speciespresenting相比更大的基因组大小,如三叶草被(956 Mb;35)和大豆(1103 Mb;36)。转位因子wereshown代表45%的基因组。此外,卫星DNAswere还在基因组层面特征如khipu和Nazcapresenting相同的528 pb单元大小和subtelomeric andcentromeric分布,分别(37、38).2.2(图1)。复杂的阻力集群往往对应但不是alwaysto大NB-LRR clustersThe全基因组序列的可用性提供了一个uniqueopportunity研究问序列的分布。com-plete组问蛋白被发现在一个反复的过程。首先,预测蛋白质序列的一个嗯搜索Phase-olus(p .寻常的G19833;变得,版本1.0)是为了identifysequences包含NB-ARC域。此外,identifyhomologs(如不同或不被确认为羊痘疮theautomated注释)错过了在第一步中,所有问predictedproteinpredictedprotein序列中确定第一步被用作查询totBLASTn整个基因组4。总共376 NLs基因,which106 TNLs和270主办,被确定(图1)。绝大多数ofNLs序列是身体组织的复杂的集群,oftenlocated染色体末端的(图1)。特别是,threelarge集群是位于染色体末端的Pv04,Pv10and Pv11和包含40多个NLs基因enrichedfor CNL(Pv04和Pv11)或TNL(Pv10)基因。对于这些三大NLclusters,大量khipu卫星序列(inpink呈现在图1)也在场。抗病性的遗传研究的长期共同的bean。例如,p . vul-garis之间的交互和c . lindemuthianum是第一个报告race-cultivarspecificity39-41。许多疾病R基因多样化pathogenshave经过基因映射和/或相关分子markersdescribed图1中所示的(见参考资料)。图1给出的近似位置asynthesis基因characterizedR在菜豆对各种病原体的基因。大多数thecomplex R基因的基因簇特征超过pseudomolecules结束和对应问基因(二氧化碳、Co-32 Co-4、Co-43 Co-5,Co-6,co-8,Co-9和Co-u)和R基因的安第斯山脉起源(Co-15)18。因此,Co-x,一个稀缺的安第斯炭疽病R基因特征,出现托比特别感兴趣的R基因通过控股公司计划与otherMesoamerican R基因。参考基因组序列的基础上G19833,PCR primerpairs旨在扩大约1 kb的GC %50% frequenciesof多态性基因间区域,这些地区目前高于编码区域。引物的特异性P。寻常的基因组检查使用自定义基于Perl脚本在发表计划58。第一步,根据approximatelocation感兴趣的基因的基因组和segregatingpopulation R基因,是确定侧翼标记。然后,标记可以逐步设计基于整个genomesequence限制目标地区周围感兴趣的基因。使用此策略,55 locus-specific pcr标记与最接近gen-erated制造商定义一个58 kb间隔在Co-x基因18。这些标记构成了原材料foroptimizing,感兴趣的基因型,标记,用来在MAS(Co-x)。这一战略的局限性(i)abil-ity设计轨迹目标地区特定的引物(导致重复序列的存在),(ii)的水平polymor-phism双亲之间的隔离人口在目标地区,和(3)重组事件的数量在目标区域隔离人群。后者param-eter取决于大小和隔离的本质populationas以及基因组的目标区域的位置。的确,比较不同speciessuch遗传和物理距离的玉米、大豆和菜豆都表明dis-tal的染色体区域高度重组comparedto pericentromeric地区59 - 61。forCo-x描述的例子中,这项研究是在一个有利的背景下进行的。首先,Co-xgenetic映射进行了中美洲之间的人口瑞来斯派生从十字架上繁殖BAT93和theAndean长白猪JaloEEP558,呈现高水平的polymor-phism。此外,瑞来斯的人口,作为小informativeas F2群体遗传距离62。最后,dis-tal Co-x的位置上考虑torecombination Pv01也是一个积极点。在这种情况下,使用一个人口只有181瑞来斯,可以精细地图Co-x R基因的间隔58 kb剧中几周。这个简单和廉价策略快速identifytightly链接标记基于整个基因组序列可以用于任何耐药基因呈现在图1。Co-x R基因,其中大部分位于远端地区的染色体终究也因此受益recombina-tion在那些地区,更高水平的一个重要因素来确定密切linkedmarkers。重复序列的存在如khipu satel-lite几家大型电阻集群(Pv04年底,Pv10 Pv11)可能复杂轨迹的设计特定的引物。然而,即使大量的khipu(30 kb)现在的某个时候,他们总是被non-repeated序列themarkers应该设计优先63。这种策略是设计的另一个limi-tation pcr标记最为占主导地位的时间。这不是一个问题对于RILspopulations。然而,如果需要,如在F2野生的情况下,转换为共显性标记是可能的,即使morecomplicate和耗时。还有其他的例子全基因组序列意在设计分子标记在菜豆。狂轰滥炸之一是大量的健壮indel标记bylow通过测序发现14个不同的大豆基因型和mappingthe读取参考基因组。由此产生的“易于使用”pcr标记特定平托,黑色,海军,和肾脏beanmarket类64。另一个例子是优雅identificationof分子标记与我基因位于chro-mosome Pv02基于在硅的隔离分析(BSA)耀目豆500行和基因分型的多样性面板Illu-mina英6 k SNP BeadChip(BARCBEAN 3)65。这strategyled SNP标记的识别与我基因密切相关(25 kb)在共显性的转换KASP(Kompetitive AlleleSpecific PCR)和帽子(裂解放大多态序列)。显然这两个例子展示如何使用commonbean基因组序列可以提高molecularmarkers的发展。然而,重新排序和SNP基因分型strategiesare相当昂贵相比之前提出tar-geted pcr标记设计策略,这些策略可以看作是互补的。即使它并不重要知道anR基因的分子基础包括在MAS繁殖计划这informationmight是一个重要的标准来选择基因的结合。例如,育种者可以选择她们金字塔R基因不同的分子基础,因为他们可以阻止病原体atdifferent水平的循环。因为电阻是一个“基因型个别特质”,参考基因组(G19833)是不够的,还需要得到目标序列的基因型carry-ing R基因通过远程PCR和/或非网格BAClibrary,一个最快的替代传统网格BAC库66。基因的功能验证候选人(s)将possi-ble利用病毒诱导基因沉默(中收取),BPMV-derivedVIGS向量最近优化菜豆(51、67、68)。参考基因组序列的可用性是一个资源,无疑将促进Rgenes共同点bean.4图谱克隆。假设有关的巨大规模subtelomeric NLclusters beanIn菜豆基因组一样,大多数的R基因clustersare位于染色体的末端和现在比其他物种hugesize(图1),其中一些flu-orescence原位杂交(鱼)分析显示asubtelomeric位置。这是Pv04 B4集群的情况下,二氧化碳集群Pv11和Co-4集群Pv08(63、69、70)。关于他们的体型巨大,但它是特别令人印象深刻的为问集群位于Pv04,Pv10,Pv11 eachcontaining 40多问序列。Microsynteny analysisbased低复制基因的二氧化碳和B4集群betweensoybean和菜豆问序列的令人印象深刻的amplifi-cation菜豆唯一20 nls被确定在相应地区的大豆为B4和二氧化碳集群,分别为(63、71)。这表明地区来往菜豆是R geneproliferation有利的“利基市场”。R基因表达可能与健身相关成本在寄主植物(72、73)。因此,R基因表达需要仔细监管特别是植物物种manyNL基因。各种机制正在成为牵连在监管问序列包括microrna的调制ofNL表达式(74、75)。然而,因为这个过程不是个别刀豆,因为它已被确定在variousplant物种从番茄云杉,它无法解释的问集群hugesize菜豆(76 - 78)。特殊特性ofcommon豆基因组包括终端旋钮(het-erochromatic块)的存在,他们中的大多数包含khipu satelliteDNA63。如前所述,远端地区chro-mosomes高度重组pericentromericregions相比,因此有利于促进NL amplifica-tion通过不平等的互换。此外,identificationof大量khipu串联重复序列紧密相连的3大问Pv04集群,Pv10,Pv11表明ampli -对问序列可以被提升了unequalcrossing涉及khipu序列。此外,epigeneticsilencing邻近基因的异色的区域和重复序列通过甲基化的传播过程和已知(79、80)。因此,我们建议这pecu-liar基因环境可能支持大型Rgene集群由于扩散,不仅增加了复合,还可以让他们某种形式的沉默81允许大量扩增NLsequences没有健身成本。Subtelomeres往往被视为可变位点含有飞速发展基因家族参与自适应过程和arehot斑点染色体间的重组(82、83)。的plas-ticity subtelomeres被描述在各种organismssuch酵母,锥体虫,真菌与人类,然而信息缺乏植物subtelomeres(82、83)。豆一样,使用系统的组合和鱼的方法,我们提出,B4集群(Pv04)源自Co-2cluster(Pv11)之间通过一个异位重组异源染色体subtelomeric地区63。Wholegenome菜豆序列在基因组层面提供了独特的possibilityto研究物理andphylogene