大规模动物细胞培养的研究进展.doc

动物细胞大规模培养技术的研究进展作者：王珍 指导老师：袁学军摘要：动物细胞培养作为生化工程学科领域中迅速发展起来的生物技术与化学工程结合的新型学科，无论在基础研究和应用研究方面都越来越受到生物技术界的重视，现已成为生化工程学科主要前沿学科之一。利用动物细胞大规模培养技术可生产多种生物制品，为了提高为提高细胞活力和细胞生长密度, 采用有多种添加成分的无血清培养基培养细胞, 选择既有利于细胞生长又可提高培养细胞密度的微载体和条件温和、易操作、气体交换速度快的生物反应器, 在线监控细胞生存环境和生理活动, 减少培养过程中培养基的抑制因素, 从而给细胞提供更好的生存环境; 另外通过向细胞中导入抗凋亡基因, 可减缓细胞凋亡的发生, 提高细胞活性和蛋白产量; 此外, 在动物细胞大规模培养过程中, 利用多孔微载体能高效、大量地增殖细胞, 具有良好的应用前景.关键词: 动物细胞; 培养环境; 生物反应器; 微载体Research advance in large-scale culture of animal cellsAbstract: The technology of animal cell culture is one of the frontiers which combines biotechnology with chemical engineering, and develops rapidly. It plays a more and more important role in both basic and applied research, and is becoming a unique high tech industry and displays tremendous prospects for industrial development. Many biological products were manufactured by means of large- scale culture of animal cells. To increase cell- specific productivity and cell density, serum- free media supplemented with several nutriments were used for cell culture, and microcarriers were chosen in favor of cell growth and high cell density. Biore actors with simple manipulation, good qualification and aeration were adopted. More suitable conditions for cell growth could be given through on- line supervising the environment for cell growth and restraint factors in cell culturing. Furthermore, the anti- apoptosis genes using recombinant DNA technology can increase cell viability and productivity. Porous microcarriers was emphasized in large- scale culture of animal cells.Keywords: animal cell; culture environment; bioreactor; microcarrier search advance in large-scale culture of animal cells.一、细胞培养技术概述动物细胞培养开始于本世纪初,1962年, 其规模开始扩大, 发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法, 利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等, 已成为医药生物高技术产业的重要部分1 ，利用动物细胞培养技术生产的生物制品已占世界生物高技术产品市场份额的50% 2 ，大量资料表明, 生物技术药物是当前新药开发的重要领域, 生物技术制药工业是下一个10 年制药工业的重要新门类, 期间将有数百种生物技术新药上市3 ，美国最新预测几种畅销基因工程药物2000 年全球销售额EPO 大于30 亿美元, G2CSF 大于20 亿美元, HGH、IFN、U K 均大于10 亿美元, 胰岛素和降钙素大于5 亿美元4 。动物细胞大规模培养技术是生物技术制药中非常重要的环节。目前, 动物细胞大规模培养技术水平的提高主要集中在培养规模的进一步扩大、优化细胞培养环境、改变细胞特性、提高产品的产率与保证其质量上。二、动物细胞培养环境在动物细胞培养的过程中, 最重要的是使细胞培养条件达到最优化程度, 尽可能消除或减轻环境对细胞的影响, 维持细胞高存活力和高效表达, 同时又要充分考虑细胞表达产物的后续纯化,因此动物细胞培养环境的控制是细胞培养的关键技术。而影响细胞培养的主要因素有溶解氧、CO2、温度、pH 值、葡萄糖、氨、乳酸、甲基乙二醛、培养基成分等 5。一般而言, 细胞培养所需的最适溶解氧浓度为20% 50% , 最适CO2 水平为4% 10% , 温度大多数为37 e , pH 值为7. 0 7. 4。葡萄糖是细胞培养过程中主要的能量来源, 因此必须维持在一定的水平。氨、乳酸、甲基乙二醛等是动物细胞培养的主要限制因素。氨离子抑制谷氨酰胺(Gln) 代谢途径, 因此要防止培养基中Gln 的自然分解, 要限制Gln 用量, 并尽可能去除培养基中的氨; 高浓度乳酸抑制细胞生长, 应降低培养基中葡萄糖浓度以减少乳酸产生, 所以在大规模动物细胞培养中常常添加果糖, 以减少葡萄糖的使用量;甲基乙二醛能改变氨基酸、蛋白质和核酸的氨基和巯基, 也主要通过降低葡萄糖用量来降低甲基乙二醛的浓度。动物细胞培养基是细胞赖以体外生长、增殖、分化的重要因素。一般情况下, 动物细胞的生长均有赖于血清的存在. 但使用血清主要存在潜在的污染源、不同批次间蛋白含量差异大及价格高等弊端6 , 给生物制品的生产造成了不便, 这就引发了人们对无血清培养基的研究. 结果发现, 只要在培养基中添加某些适于细胞生长的成分, 如纤连蛋白、转铁蛋白、胰岛素和表皮生长因子等, 多种细胞即可在无血清供应的情况下生长 7 , 尤其是中华仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO) 细胞、杂交瘤细胞及重组骨髓瘤细胞等, 其中胰岛素是无血清培养基中促进动物细胞生长最重要的多肽. CHO 细胞能在仅含重组人胰岛素的一种蛋白成分的无血清培养基中连续传代 8 . 在人类细胞培养中, 某些细胞在无血清的条件下, 其生长和抗体的产量甚至比有血清的培养基高出数倍. 另外, 应用无血清培养基还能有选择性地控制及避免成纤维细胞的过度生长. 应用无血清培养基培养动物细胞的成功, 还将为某些痘苗的生产降低成本9 . 2.1生物反应器的选择在生物制品生产中，动物细胞培养已越来越重要。动物细胞的大规模培养需要特殊的生物反应器，微生物和植物细胞不同, 动物细胞的外层是质膜, 脆性大, 在反应器中务必减少剪切力10 。自70 年代以来, 用于动物细胞培养的生物反应器有很大的发展, 种类越来越多, 规模越来越多， 根据生物反应器的用途不同, 有悬浮培养用、贴壁培养用和包埋培养用生物反应器等11 。 2. 1.1气升式(air lift) 生物反应器气升式生物反应器的基本原理是气体混合物从底部的喷射管进入反应器的中央导流管, 使得中央导流管侧的液体密度低于外部区域从而形成循环。 气升式生物反应器主要采用内循环, 但也有采用外循环。1979，Katinger 等首次应用气生式生物反应器进行动物细胞悬浮培养英国Celltech公司是应用气生式生物反应器进行动物细胞大规模培养的成功范例,1985 年应用100L 规模的气生式生物反应器进行大规模培养杂交瘤细胞该公司已经开发出了10000 L 规模的气生式生物反应器用于各类单抗的大量生产L国内已经有人设计制造了10L规模的气生式生物反应器用于培养哺乳动物细胞、昆虫细胞等各类生物制品12。 2. 1.2中空纤维管(hollow fiber) 生物反应器其原理为泵动培养液通过成束的合成空心纤维管(毛细管) 而使细胞固着在毛细管内壁生长。如果毛细管的直径为350 Lm, 表面积体积比率为30. 7, 大量成束的毛细管内壁提供了大量的生长表面积。它的用途较广, 既可培养悬浮生长的细胞, 又可培养贴壁依赖性细胞, 胞密度最高可达109mLL 主要用于杂交瘤细胞生产单克隆抗体。2.1.3流化床(f lu idiz bed) 生物反应器(FBR )流化床生物反应器的基本原理是培养液通过反应器垂直向上循环流动, 不断提供给细胞必要的营养成分, 使细胞得以在微粒中生长; 同时, 不断加入新鲜培养液L这种反应器的传质性能好, 并在循环系统中采用膜气体交换器, 能快速提供给高密度细胞所需要的氧, 同时排出代谢产物; 反应器中的液体流速足以使细胞微粒悬浮却不损坏脆弱的细胞L 流化床生物反应器满足了高密度细胞培养, 使高产量细胞长时间停留在反应器中, 优化了细胞生长与产物合成的环境等细胞培养的要求。可用于贴壁依赖性细胞和非贴壁依赖性细胞的培养13 。2.1.4搅拌罐( stirtank) 生物反应器(STR )B. B raunMD10 搅拌罐生物反应器, 内装一个100 Lm 孔径的旋转滤器, 工作体积为8 L个数字控制装置(DCU ) 用于控制温度、pH 值、搅拌速度和溶氧(DO ) L底部的环形喷气结构起通气作用9 L 新鲜培养基分散进入旋转滤器的外部区域, 从旋转滤器的中间获得无微载体的收集液L旋转滤器一般由不锈钢丝网构成, 有良好的生物相溶性, 易于清洗和消毒, 可重和长期使用L这种装置已经大规模悬浮培养多种细胞。2.1.5固定床(fixed bed) 生物反应器在流化床玻璃柱的底部加一个有0. 5 mm小孔的钢网L但培养基循环的方向相反, 微载体堆积于钢网上没有移动L 固化床内的线性流速减低至14cmm in (流化床内的线性流速75cmm in) , 气体通过硅胶膜扩散L 把外部通气装置的通气管长度从10m 缩短至2m , 可以减少工作体积大于70100mL 开孔玻璃载体(硼酸硅玻璃) 直径400700 Lm, 孔径60120 Lm, 孔积率50% , 可供细胞附着14。2.1.6堆积床(packed bed) 生物反应器Celligen Plus 堆积床生物反应器的工作原理为: 当推进器( impeller) 旋转时, 培养基通过推进器的中心空管螺旋式地从罐体底部往上流, 然后从3 个出口中流出, 通过堆积床向下流动至罐体底部, 再通过推进器的中心管往上流L细胞附着在堆积床的聚酯片上, 气体从喷射器喷出进入培养基中L 通过调节气体混合物的组成成分, 完成对pH 和DO 的控制, 加入氧气或氮气以满足培养过程中氧气的吸收; 当pH 太高时加入CO 2; 空气作为一种填充气体, 保持气体进入罐体时流速的稳定L 培养基通过蠕动泵从培养基储存瓶(mediareservoir) 中进入反应器, 收集液通过蠕动泵从反应器中流出进入收集瓶L堆积床有以下特点: 贴壁依赖性和悬浮细胞可成功地在堆积床内附着; 细胞不接触气液界面, 低漩流和低剪切力, 细胞受到的伤害很小; 反应器能以分批式或连续灌流方式运转, 并可维持长时间; 聚酯片提供高的表面积体积比率, 维持高细胞密度。21.7一次性(disposable) 生物反应器这种生物反应器由预先消毒的、FDA 认可的、对生物无害的聚乙烯塑料箱组成, 箱中部分填充培养基并接种细胞L箱中其余部分是空气, 培养过程中空气连续通过这里, 空气通过完整的过滤器进入箱体L前后摇动箱体使液气界面产生波动,大大提高了氧气的溶解量, 有利于排出CO 2 控制pH 值, 也促使培养液混合均匀, 细胞和颗粒不会下沉L 废气通过一个消毒过滤器和逆止阀L 整个生物反应器置于传统的细胞培养用CO 2 培养箱中, 便于控制温度和pH 值, 或者在箱体底部加热控制温度L培养细胞的密度可达到7106mL21和100 L 的工作体积L使用前箱体用C射线消毒, 用后丢弃L 特殊的开孔可进行无菌加样、取样, 而不必把生物反应器置于层流罩中L装置简单, 易于操作, 成本低, 低剪切力, 无空气鼓泡减低了气泡对细胞的损害L可用于培养动物细胞和植物细胞, 并十分适合生产病毒15 ，已经此反应器成功悬浮培养重组N S0 细胞生产单克隆抗体; 悬浮培养人293 细胞生产腺病毒(adenovirus) ; 用昆虫sf9 细胞生产棒状病毒( baculovirus ) ; 用微载体Cytodex3 培养人393 细胞。2.2微载体培养研究进展 2.2.1微载体培养的发明和发展微载体培养首先是由A1 L1 Van Wezel于1967 年提出, 其方法在培养动物细胞时, 将制备好的细胞悬液和事先在血清中浸泡并消毒过( 可加快细胞与微载体的贴附速度) 的微载体混合孵育一段时间, 待细胞贴附于微载体上后, 再转移至培养液中培养, 并借助温和搅拌系统使细胞随载体均匀悬浮于培养液中16 。它所采用的微载体通常是直径为60 250 Lm的固体小珠, 材料大致有纤维素、塑料、明胶、玻璃和葡聚糖五大类, 近年来国外又相继开发出多种材料的微载体, 如液体微载体、聚苯乙烯微载体、PHEMA 微载体、甲壳质微载体、藻酸盐凝胶微载体等。微载体技术经过30 余年的发展逐渐完善和成熟, 并已广泛应用于细胞工程领域。目前, 利用微载体系统进行组织工程细胞的大规模培养受到医学科研人员青睐, 而且其研究发展非常迅速, 已成功利用该技术进行了肝细胞、成纤维细胞、生肌细胞、软骨细胞等细胞系的大规模培养17。22.2微载体培养的优点微载体培养一定程度上克服了最初的转瓶培养的不足, 具有很多优点18 : ( 1) 兼具单层培养和悬浮培养的优势, 且是均相培养; ( 2) 细胞所处环境均一; ( 3) 环境条件( 温度、pH 和CO2 等) 容易测量与监控; ( 4) 具有较高的比表面积; ( 5) 培养操作可系统化、自动化, 降低了污染发生的机会。2.3培养过程的在线监控在动物细胞的大规模培养中, 生物离线取样特别是产物浓度测定需要较长的时间, 不能及时反映细胞生存环境中的各种参数变化, 因而在线过程监控在动物细胞的大规模培养中具有非常重要的地位, 可以创造适合细胞生存的最佳环境, 减少污染等. 目前在培养过程中已经能对温度、pH 值、溶解氧浓度进行在线分析, 并可进行有效控制. 最近几年, 有关细胞培养过程监控的研究迅速增多, 在线测量氧吸收速率, 可以确定从细胞生长期生产病毒到感染期和细胞死亡后终止感染的转换时间; 用在线葡萄糖分析仪的测定来调整灌流速度等19 . 另外, 估测目前和未来生物反应过程中葡萄糖的吸收率及乳搪的生成率的软件也已经研制成功20, 这使得对细胞培养过程的状态监控更加及时、准确.五、展望经过几十年来的研究与实践, 目前虽然动物细胞大规模培养技术还存在不少问题, 但较之几十年前已是质的飞跃. 随着这一技术的进一步发展, 人们还将不断努力, 研制更理想的生物反应器, 以获得高密度、高活力的细胞; 开发新的无血清培养基, 使细胞的生长状态更好, 生物制品更安全; 目前的微载体虽在某些方面进行了改善, 但总体上还不能很好地同时满足操作简便、系统稳定、经济合理、生物相容性好以及对细胞的机械保护等诸多要求。应研制满足上述要求、细胞生长性能优良、吸附细胞容易并能重复使用的新型微载体。建立细胞培养与产物分离的涡合系统, 充分利用培养液, 以降低生产成本等, 从而使动物细胞培养技术在生物制品制备和基因工程等领域得到更广泛的应用。参考文献(References) : 1 林福玉, 陈昭烈, 刘红, 等. 大规模动物细胞培养的问题及对策J . 生物技术通报(L IN Fu yu, CHEN Zhao lie, L IU Hong, et al. P roblems and so lutions of large-scale mammalian cell culture J . Biotechnology Information ) ,1999, 1: 32235. 2 陈昭烈. 动物细胞培养过程中的凋亡 J . 生物工程进展(CHEN Zhao2lie. Apop to sis in animal cell culture J .P rogress in Bio techno logy ) , 1998, 18 (6) : 17220. 3 吴梧桐. 下一个10 年的生物技术与生物制药J . 中国药学杂志(WU W u tong. Biotechnology and pharmaceuticals 10 years laterJ . Chin Pharm) , 1999, 34 (1) : 326. 4 丁锡中. 基因工程药物的过去、现在和将来J . 生物工程进展(D IN G Xi2zhong. The past, nowadays and future ofdrugs of gene engineeringJ . P rogress in Bio techno logy ) ,1998, 18 (3) : 226. 5 RYLL T , VALLEY U, WAGNER R, et al. Biochemistry of growth inhibit ion by ammonium ions in mammalian cells J . Biotech Bio eng , 1994 , 44 : 184-193. 6 VOIGE A , ZIML F. Hybridoma cell growth and anti2neuroblasona monoclonal antibody production in spinner fleeks using a protein2freemedium with microcarrier J . J Biotechnol, 1999, 68( 2- 3) : 213- 226. 7 SINACANE M S, DRAPEAU D, ADAMSON S K. Adaptation of mammalian cells to growth in serumfree media J . Mol Biotechnol,2000, 15( 3) : 249. 8 徐 冰. 大规模哺乳动物细胞培养 J . 国外医学: 预防、诊断、治疗用生物制品分册, 1997, 20( 5) : 212. 9 忻亚娟, 朱家鸿. 动物细胞培养技术的进展 J . 浙江预防医学, 2001, ( 14) : 48- 50. 10梅乐和. 生化生产工艺学M . 北京: 科学出版社(M E IL e2he. P rocess of biochem ical p roductionM . Beijing: ScienceP ress) , 1999. 2112217. 11 谭文松, 陆健, 张元兴. 气生式生物反应器在杂交瘤细胞培养中的应用J . 生物工程学报(TAN W en2song, LU J ian,ZHAN G Yuan2xing. App lication of the airlift bio reacto r for hybridoma cell culturesJ . Ch inese Journal of Bio techno2logy) , 1996, 12 (4) : 4772481. 12 KON G D, CARDA K S, CHEN M , et al. H igh cell density and p roductivity culture of Ch inese ham ster ovary cells in