应用微纤维胶原支架构建组织工程软骨.doc

www.CRTER.org周丽斌，等. 应用微纤维胶原支架构建组织工程软骨应用微纤维胶原支架构建组织工程软骨周丽斌1，徐冰心2，丁瑞英2，韩浩伦2，王 刚2，李保卫2，王鸿南2，吴 玮2(1广州医科大学附属口腔医院广州口腔疾病研究所口腔医学重点实验室，广东省广州市 510140；2解放军第306医院耳鼻咽喉头颈外科，北京市 100101)引用本文：周丽斌，徐冰心，丁瑞英，韩浩伦，王刚，李保卫，王鸿南，吴玮. 应用微纤维胶原支架构建组织工程软骨J.中国组织工程研究，2017，21(22):3483-3487.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.22.007 ORCID: 0000-0002-4810-9801(周丽斌)文章快速阅读：以微纤维胶原为支架材料构建组织工程软骨兔耳软骨体外接种消化分离体外培养微纤维胶原支架软骨细胞手术植入 人工软骨评价 组织学分析 (苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色、番红O染色) 型胶原免疫组化染色裸鼠体内培养形成人工软骨文题释义：微纤维胶原：Avitene微纤维胶原从小牛真皮提取，是一种天然胶原蛋白，完全保留了生物活性和微观基本形态，是内源性凝血机制中的重要作用成分。微纤维胶原主要用于外科临床止血，可通过腔镜用于腔隙内止血，也可缝合固定用于血管性出血的止血，可长期留存于体内。大量的临床应用研究报道证明微纤维胶原具有良好的生物安全性。组织工程：从机体获取少量的活体组织细胞，在体外进行培养扩增，然后将扩增的细胞与具有良好生物相容性、可降解性和可吸收的生物材料(支架)按一定的比例混合，使细胞黏附在生物材料(支架)上形成细胞-材料复合物；将该复合物植入机体的组织或器官病损部位，随着生物材料在体内逐渐被降解和吸收，植入的细胞在体内不断增殖并分泌细胞外基质，最终形成相应的组织或器官，从而达到修复创伤和重建功能的目的。摘要背景：寻找理想的组织工程支架材料，仍然是软骨组织工程学的重要课题之一。目的：探讨微纤维胶原应用于软骨组织工程支架的可行性。方法：手术切取兔耳软骨，提取原代软骨细胞，并进行扩增培养。将海绵状微纤维胶原用无菌刀片切割成小方块，取第2代软骨细胞混悬液接种于微纤维胶原支架材料上。体外培养1周后，植入裸鼠体内，观察8周后取材，进行大体、组织学、免疫组织化学等方法观察。周丽斌，男，1982年生，江西省余江县人，汉族，2011年解放军第四军医大学毕业，博士，副主任医师，主要从事软骨组织工程方面的研究。 通讯作者：吴玮，博士，教授，主任医师，解放军第306医院耳鼻咽喉头颈外科，北京市 100101 中图分类号:R318文献标识码:A文章编号:2095-4344(2017)22-03483-05稿件接受：2017-02-17Zhou Li-bin, M.D., Associate chief physician, Key Laboratory of Oral Medicine, Guangzhou Institute of Oral Disease, Stomatology Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510140, Guangdong Province, ChinaCorresponding author: Wu Wei, M.D., Professor, Chief physician, Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery, the 306th Hospital of PLA, Beijing 100101, China结果与结论：在细胞接种过程中，湿水之后的微纤维胶原支架无明显缩水，仍然能够保持其立体形态；体外培养1周以及植入体内8周后，无明显体积和形态变化；裸鼠体内培养8周后形成白色半透明且富有弹性的成熟软骨块；组织学观察可见所构建的软骨组织成熟，基质分泌旺盛，组织内仍可见未完全降解的微纤维胶原材料；结果表明，微纤维胶原蛋白是一种良好的软骨组织工程支架材料。关键词：生物材料；软骨生物材料；微纤维胶原；软骨细胞；软骨；组织工程；国家自然科学基金主题词：纤维胶原类；软骨细胞；软骨；组织工程基金资助：国家自然科学基金青年科学基金项目(81401609)Tissue-engineered cartilage construction using microfibrillar collagen Zhou Li-bin1, Xu Bing-xin2, Ding Rui-ying2, Han Hao-lun2, Wang Gang2, Li Bao-wei2, Wang Hong-nan2, Wu Wei2 (1Key Laboratory of Oral Medicine, Guangzhou Institute of Oral Disease, Stomatology Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510140, Guangdong Province, China; 2Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery, the 306th Hospital of PLA, Beijing 100101, China)3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 AbstractBACKGROUND: To seek for ideal scaffold materials is still an important task for cartilage tissue engineering.OBJECTIVE: To investigate the application of the Avitene microfibrillar collagen hemostat sponge in cartilage tissue engineering.METHODS: Rabbit auricular cartilage was harvested via surgical operation, and primary chondrocytes were isolated and amplified. Microfibrillar collagen hemostat sponge was cut into small bricks. The passage 2 chondrocytes were suspended and seeded onto the spongy bricks. After 1 week of in vitro culture, the constructs were then implanted into nude mice. After 8 weeks, the specimens were collected and evaluated using gross, histological and immunohistochamical observation.RESULTS AND CONCLUSION: During the cell seeding, the scaffold maintained its dimensions. No shrinkage was observed when the cell suspension was added. There was no considerable change in dimensions during the 1-week in vitro culture and at 8 weeks after implantation in nude mice. At 8 weeks post-implantation, mature cartilage blocks were harvested, which were white, translucent, and flexible. Histologically, the constructs appeared to have typical mature cartilaginous tissues, with robust extracellular matrix secretion, in which the microfibrillar collagen was incompletely degraded. We conclude that the microfibrillar collagen is a favorable scaffold material for cartilage tissue engineering.Subject headings: Fibrillar Collagens; Chondrocytes; Cartilage; Tissue EngineeringFunding: the National Natural Science Foundation of China, No. 81401609Cite this article: Zhou LB, Xu BX, Ding RY, Han HL, Wang G, Li BW, Wang HN, Wu W. Tissue-engineered cartilage construction using microfibrillar collagen. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2017;21(22):3483-3487. 3487ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction支架材料是经典组织工程理论中种子细胞形成组织之前赖以生存和依附的生物材料，它能将细胞固定于一定位置，为其生长、繁殖、新陈代谢及细胞外基质分泌等生理活动提供场所，并引导再生组织基本形状。迄今为止，缺乏理想的支架材料仍然是软骨组织工程的瓶颈问题之一，寻找理想的组织工程支架材料，仍然是软骨组织工程学的重要课题。组织工程支架材料必须具备优越的生物性能，除满足生物相容性外，一般还需具有以下特性：高孔隙率的三维立体结构，具备一定的强度，可控的生物可降解性，良好的表面活性，良好的可塑性等1-2。经过20年的研究，很多种材料被引进到组织工程领域，包括人工合成和天然多孔材料或水凝胶聚合物等3-18。尽管众多材料被开发或应用于组织工程研究，但现有材料仍存在许多问题，例如潜在的免疫原性、较低的生物活性、不匹配的降解速率、不可控的细胞材料相互作用等19-21。Avitene微纤维胶原(又被称为微纤维止血胶原，Microfibrillar Collagen Hemostat，MCH)是一种天然胶原蛋白，从小牛真皮提取，完全保留了生物活性和微观基本形态，是内源性凝血机制中的重要作用成分。微纤维胶原的临床应用已有数十年的历史，可通过腔镜用于腔隙内止血22，可缝合固定用于血管性出血的止血，可长期留存于体内23。大量的临床应用研究报道证明微纤维胶原具有良好的生物安全性24-37。电镜照片显示微纤维胶原是一种高孔隙率的疏松结构，可能成为一种良好的组织工程支架候选材料。实验通过体内外实验，验证微纤维胶原应用于软骨组织工程支架的可行性。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 对比性实验。1.2 时间及地点 实验于2015年2月至2016年4月在解放军第306医院特种医学实验研究中心完成。1.3 材料 1.3.1 实验动物 成年新西兰大白兔1只，雄性，体质量2.5 kg，8周龄雌性BALB/c裸鼠4只，体质量18-25 g，均购于北京维通利华实验动物技术有限公司。动物饲养于北京大学实验动物科学部SPF级动物中心，动物饲养及实验有创操作执行北大医学部实验动物研究相关标准。课题研究获得解放军第306医院伦理委员会审批同意。1.3.2 主要材料、试剂 海绵状微纤维胶原(AVITENE ULTRAFOAM collagen sponge，Bard Inc，美国)；陆眠宁(吉林省华牧动物保健品有限公司)；型胶原酶(美国Gibco公司)；胎牛血清(杭州天杭生物科技股份有限公司)；谷氨酰胺(美国Sigma-Aldrich公司)；L-抗坏血酸(美国Sigma-Aldrich公司)；Hams F-12培养液(美国Gibco公司)；ab34712兔源型胶原抗体(英国Abcam公司)；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(武汉博士德生物工程有限公司)。1.4 实验方法 1.4.1 兔耳软骨细胞的分离和体外培养 采取肌注陆眠宁(首剂0.15 mL/kg，半小时后追加0.1 mL/kg)将实验兔全麻，通过无菌手术，切取一侧耳郭。用碘伏溶液浸泡、反复擦拭消毒后，于超净台中解剖耳廓软骨，完整去除皮肤皮下结缔组织及软骨膜，将软骨称质量后用无菌刀片切碎至1 mm3大小，进而采用型胶原酶消化(37 ，12 h)，提取原代细胞，进一步传代扩增培养。1.4.2 软骨细胞接种 在超净台中，打开海绵状微纤维胶原(AVITENE ULTRAFOAM collagen sponge，Bard Inc，美国)的无菌包装，用无菌刀片将片状的微纤维胶原支架切割成6 mm6 mm6 mm的方块，共8块。取第2代软骨细胞，用软骨细胞培养液制成51010 L-1的细胞悬液，滴加到微纤维胶原支架上，每次滴加100 L，每30 min滴加1次，每次滴加之前将支架材料翻转，使原底面朝上。如此反复滴加软骨细胞悬液，将软骨细胞充分地接图2 应用软骨细胞和微纤维胶原支架构建形成人工软骨结构Figure 2 Cartilaginous constructs made from chondrocytes and microfibrillar collagen图注：图中A为体外培养1周、植入体内之前的大体照片；B为植入体内培育8周之后的大体标本。图1 海绵型微纤维胶原Figure 1 Microfibrillar collagen hemostat sponge图4 植入体内8周后的未接种软骨细胞的微纤维胶原蛋白支架材料(苏木精-伊红染色，40)Figure 4 Histological photograph of the implanted blank microfibrillar collagen scaffold at 8 weeks after implantation (hematoxylin-eosin staining, 40)图5 将微纤维胶原支架雕刻得到耳廓形态的软骨组织工程支架Figure 5 An auricular shaped scaffold for cartilage tissue engineering was sculptured using the microfibrillar collagen scaffold图注：图中A-D为体外培养1周、植入体内之前的标本；E-H为植入体内培育8周之后的标本。A和E为苏木精-伊红染色，B和F为甲苯胺蓝染色，C和G为番红O染色，D和H为型胶原免疫组化染色。箭头所指为人工软骨中未降解的微纤维胶原结构。图3 植入体内之前和体内培育8周之后人工软骨组织学及免疫组织化学染色(40)Figure 3 Histological and immunohistochemical appearance of the constructs after 1-week in vitro culture and at 8 weeks after implantation in nude mice (40)种到支架材料上，直至细胞悬液溢出。接种完成后，静置于37 CO2培养箱中2 h，待细胞与支架材料充分贴附。随后将接种了细胞的微纤维胶原支架移入6孔板中，加入培养液(含体积分数为10%胎牛血清，谷氨酰胺 300 mg/L，L-抗坏血酸 50 mg/L，青、链霉素各100 U/mL的Hams F-12培养液)进行体外培养。连续培养1周，每隔2 d换液1次。体外培养1周结束后，通过手术将块状结构植入BALB/c裸鼠体内。采用陆眠宁肌肉注射0.5 mL/kg麻醉，用碘伏擦拭消毒裸鼠背部，用剪刀剪开侧背部皮肤，长约 1 cm，用止血钳沿皮下钝性剥离，形成皮下组织袋，将块状结构置入袋内，拉拢缝合伤口。每只动物于左右背部制作2个不相通的皮下组织袋，每袋内植入1块接种软骨细胞的微纤维胶原。同期植入2块相同体积未接种软骨细胞的微纤维胶原作为空白对照。1.4.3 取材及标本分析 裸鼠体内培养8周后，注射过量陆眠宁，处死动物后取材。将标本与周围包裹软组织剥离，置于中性甲醛溶液中固定24 h以上，然后用梯度乙醇脱水，石蜡包埋，制作5 m厚的切片，行苏木精-伊红染色观察，甲苯胺蓝和番红O染色观察38。采用常规方法进行免疫组织化学染色，一抗为1100比例稀释后的兔源型胶原抗体，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，用二氨基联苯显色，苏木精复染细胞核38。1.5 主要观察指标 甲苯胺蓝和番红O染色反映软骨基质的分泌情况；型胶原免疫组化染色反映型胶原的表达情况；组织学染色和免疫组化染色观察支架材料的降解情况，并评价人工软骨的性能。2 结果 Results 2.1 实验动物数量分析 4只BALB/c裸鼠全部进入结果分析，中途无脱落。2.2 大体观察结果 微纤维胶原呈稀疏的海绵状结构(图1)，具有很强的可压缩性和吸附性。在细胞接种过程中，湿水之后的微纤维胶原支架无明显缩水，仍然能够保持其立体形态。体外培养1周后无明显体积和形态变化(图2A)。植入裸鼠体内，进行体内培育8周后，形成白色半透明且富有弹性的成熟软骨块(图2B)。取材时，人工软骨被纤维组织包裹，这层组织囊可以通过剥离而被轻易去除。空白对照的微纤维胶原材料未完全吸收，但体积明显减小，呈白色柔软的胶样结构，被周围结缔组织包裹，较难解剖。2.3 组织学及免疫组化观察结果 软骨细胞接种于微纤维胶原支架后，细胞与支架材料贴附，微纤维支架材料在甲苯胺蓝染色中不显色，在番红O染色中被染成粉红色，另外，在型胶原免疫组化染色中，观察到支架材料与型胶原抗体反应，说明微纤维胶原支架中包含有型胶原成分(图3)。体内培养8周后，组织学观察人工软骨结构，可见软骨细胞形态成熟，软骨细胞位于软骨陷窝之中，软骨陷窝在组织中分布均匀，软骨基质丰富，基质中可分辨出尚未降解的微纤维胶原支架材料。甲苯胺蓝染色和番红O染色证明人工软骨基质中糖胺聚糖含量丰富，免疫组化染色观察到软骨基质中型胶原强阳性表达(图3)，而在人工软骨的间隙内，可见到未降解的微纤维胶原支架材料中型胶原的表达(图3H)。空白对照组镜下可见未被降解的微纤维胶原蛋白结构，间隙内裸鼠结缔组织细胞长入，新生血管生成(图4)。3 讨论 Discussion微纤维胶原支架材料是一种动物来源的天然胶原蛋 白22-23，实验发现其中含有型胶原成分。Avitene微纤维胶原已经获批进入临床应用数十年，已成为外科手术以及微创外科手术中常用的止血材料，可长期留置于体内，不引起免疫排斥反应，可在90 d内被完全吸收，相关的并发症或不良反应极少见报道22，39-40。实验研究发现，微纤维胶原蛋白是一种良好的软骨组织工程支架材料。在体外接种软骨细胞过程中，微纤维胶原支架吸水后不发生变形、不易碎裂。体内培育过程中仍然能够抵抗一定的皮肤张力，保持其立体形态，从而使其具备了构建特定形态人工软骨的可能性，例如人工耳廓。实验观察到微纤维胶原支架具有良好的生物相容性，容许软骨细胞贴附生长，并且能够引导软骨细胞分泌细胞外基质形成软骨组织。组织学研究发现，在构建的人工软骨标本中，微纤维胶原支架材料被新生的软骨基质包裹，支架和新生软骨之间无缝隙结合，已经成为了软骨基质的一部分。文献报道中，Avitene微纤维胶原在体内完全降解需要3个月时间22，40。实验研究发现，不论是组织工程软骨，还是空白的植入材料，在裸鼠体内8周时均未完全降解。在软骨组织工程构建过程中，这种微纤维胶原支架材料的最终转归如何，降解速率等问题，仍需进一步实验研究探讨。下一步的研究计划将检测微纤维胶原支架的生物物理性能，包括对其孔隙率以及体内降解速率的检测，观察其在正常免疫功能动物体内的生物相容性等。另外，更远期的研究计划是应用微纤维胶原蛋白支架构建组织工程耳廓软骨，将微纤维胶原支架雕刻形成耳廓形态(图5)，通过细胞接种和体内外培养，构建出具有耳廓形态的人工软骨。作者贡献：实验设计为周丽斌，实验主要实施、资料收集、数据整理，论文撰写为周丽斌，实验辅导为吴玮，协助实施实验及数据采集、分析为徐冰心、丁瑞英、韩浩伦、王刚、李保卫、王鸿南。利益冲突：所有作者共同认可文章无相关利益冲突。伦理问题：实验过程遵循了国际兽医学编辑协会关于动物伦理与福利的作者指南共识和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。文章撰写与编辑修改后遵守了动物实验体内实验研究报告规范指南(ARRIVE指南)。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。作者声明：通讯作者对于研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。开放获取声明：这是一篇开放获取文章，文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。根据知识共享许可协议“署名-非商业性使用-相同方式共享3.0”条款，在合理引用的情况下，允许他人以非商业性目的基于原文内容编辑、调整和扩展，同时允许任何用户阅读、下载、拷贝、传递、打印、检索、超级链接该文献，并为之建立索引，用作软件的输入数据或其它任何合法用途。4 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