魔芋中活性成分的联产工艺的研究.docx

魔芋中活性成分的联产工艺的研究摘 要：魔芋中活性成分的联产工艺研究，对提高魔芋的综合利用率、降低生产成本、增加附加经济值具有十分重要的价值，同时可大大提高企业经济效益，对大规模开采和利用魔芋中活性成分的药用价值具有指导性作用。用正交优化试验考察了各因素对神经酰胺与生物碱的提取率的影响，确定最佳提取工艺条件为：提取温度60、乙醇体积分数70%、提取时间20min、料液比1: 4；纯化后的神经酰胺提取率达0.047%，纯度为80.77%；生物碱提取率达0.041%，纯度为71.68%；用乙醇沉淀法从魔芋残渣中提取KGM类化合物，提取率达51.16%，纯度为93.86%。关键词：联产工艺；魔芋；葡甘聚糖；生物碱；神经酰胺中图分类号：TS201.2 文献标识码：AStudy on the Joint Producing Technology of the Active Ingredients from KonjacZHOU Xiu-xiu (School of Chemistry, Chemical Engineering and life Science, Wuhan University of Technology, Wuhan 430070,China)Abstract: Studing on the joint producing technology of the acive ingretdients from konjac plays very significant meaning for raising comprehensive use,decreasing production cost,increasing added economic value and benefit.Whats more,it provides value function on the medicinal value of active ingredients from konjac in large scale exploitation and utilization.The best technical conditions were obtained through orthogonal experiments as follows: tempeature 60，70% ethanol, time 20min, liquid material ratio 1:4. In this condition, extraction rate of the crude extracts was 15.75%. After separated and purified, the ceramide was 0.047%, purity was 80.77%; the alkaloid was 0.041%, purity was 71.68%; the extraction rate of KGM was 51.16% by ethanol precipitation method, and the purity was 93.86%.Keywords: Joint Producing Technology, Konjac, Konjac glucomannan, Alkaloids, Ceramides, UAE魔芋是一种药食两用的草本植物1，其主要成分是葡甘聚糖（Konjac glucomannan, KGM），是目前发现的唯一能大量提供KGM的经济作物，并富含神经酰胺、生物碱等功能性成分，及人体所需的10多种氨基酸和多种微量元素2。魔芋中的活性成分满足了目前国内外人们对绿色食品和有机食品的要求，提高了魔芋在卫生、医药、环境等领域中的应用价值。因此对魔芋中活性成分的提取具有十分重要的医用和环境保护意义。目前，已有很多文献报道单独提取魔芋中KGM、神经酰胺和生物碱等活性成分。但未见采用联产工艺法对魔芋中活性成分进行系统地分离纯化的报道。单独提取魔芋中的活性成分，不仅没有实现资源的综合利用，更造成了资源浪费和环境污染。采用联产工艺提取魔芋中活性成分，并确定联产的最佳提取分离工艺条件，不仅提高了魔芋的综合利用率、降低了生产成本、增加了附加经济效益和提高了企业经济效益，而且对大规模开采和利用魔芋中活性成分的药用价值具有指导性作用，为魔芋的市场化应用提供了可能性。1 材料与方法1.1材料与仪器实验所用的花魔芋采自湖北恩施，花魔芋块茎洗净后切片，晾干。干燥后经粉碎机粉碎至100200目，制得魔芋干粉甲醇、乙腈（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；饱和苦味酸、蒽酮、- 萘酚（AR，国药集团化学试剂有限公司）；苯甲酰氯（AR，上海金山亭新化工试剂厂）；柱层析硅胶（200300目）、薄层层析硅胶G（CP，青岛海洋化工有限公司）；实验用水均为二次蒸馏水。FW80高速万能粉碎机（北京科伟永兴仪器有限公司）；KQ5200E超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；85-2磁力搅拌器（常州国华电器有限公司）；1.2实验方法1.2.1提取魔芋中活性成分的单因素实验单因素试验中选择提取溶剂浓度、料液比、提取时间、提取温度、提取级数5个因素，研究其变化对超声辅助提取方法中神经酰胺类和生物碱类化合物的提取效果的影响。在探讨其中一种因素对提取效率的影响时应确定其他因素的条件固定不变，以魔芋粉粗提物的提取得率为神经酰胺的提取效果的参考指标，用制作标准曲线相同的方法测定生物碱类化合物的含量。1.2.2提取魔芋中活性成分的正交优化实验本文在单因素的基础上，确定了正交试验的四因素和三水平，如表1所示，其中以魔芋粉粗提物的提取得率作为神经酰胺的提取效果的参考指标，制作标准曲线，用相同的方法测定生物碱类的含量。表1 正交试验因素水平表Tab. 1Quadrature Level Pilot Factor Table水平ABCD乙醇浓度/ %料液比/ gml-1温度/ 时间/ min1235060701: 21: 31: 45060701520251.2.3提取魔芋中活性成分的联产工艺流程如图1所示，由最佳工艺条件提取得到的粗提物经旋转蒸发仪浓缩至一定程度，得浓缩液，用一定体积的石油醚萃取三次（石油醚的用量依次为浓缩液的1/2、1/3、1/4），收集石油醚层并用旋转蒸发仪浓缩，所得浓缩物置于真空干燥箱中干燥，得神经酰胺粗提物。采用柱层析、重结晶等分离技术对神经酰胺粗提物进行分离纯化。魔芋粗提物经石油醚萃取后的水层，减压浓缩至一定体积，加入3.0mol/L H2SO4调节溶液pH为2.0 3.0，离心，固体保存（检测是否含有黄酮类化合物），取上清液，加氨水调pH10，氯仿萃取三次（氯仿的用量依次为浓缩液的1/2、1/3、1/4），合并氯仿液，经旋转蒸发仪浓缩并于真空干燥箱中干燥，得黄褐色生物碱类提取物。同样采用柱层析、重结晶等分离技术对生物碱类提取物进行分离纯化。将经乙醇溶液提取之后的魔芋残渣干燥，经石油醚两次脱脂，于通风厨处自然挥发干燥，1%溶胀，搅拌4h，加水稀释，离心，弃去残渣，取上清液，旋转蒸发浓缩至一定体积，加85%乙醇溶液，KGM析出，无水乙醇洗涤两次，丙酮洗涤两次（溶剂回收），置于真空冷冻干燥箱中干燥过夜，得KGM精品。石油醚萃取后的水层抽滤、减压压缩魔芋粉超声辅助提取法浓缩液石油醚萃取石油醚萃取后的油层魔芋残渣减压浓缩挥发结晶、重结晶神经酰胺纯化样品石油醚脱脂离心，弃清液图1魔芋中活性成分的提纯工艺流程图Fig.1Purification Process Flow Diagra of Konjac浓缩H2SO4调PH=2.03.0离心取上层清液氨水调PH10.085%乙醇沉淀乙醇、丙酮洗涤真空干燥KGM精品挥发干燥1%溶胀离心，取上层清液减压浓缩LF萃取浓缩柱层析挥发结晶、重结晶生物碱纯化样品2 结果与讨论2.1单因素实验2.1 .1乙醇浓度对提取得率的影响准确称取五份魔芋粉（精确至0.0001g）于五支锥形瓶中，分别以50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液为溶剂，料液比为1:3，在60温度下超声20min，考察乙醇浓度对神经酰胺、生物碱提取率的影响，如图2所示：图2乙醇浓度对提取得率的影响Fig.2 Effect of the Ethanol Concentration on Extraction Content结果表明，随着乙醇浓度的增加，提取得率会随着增加，乙醇浓度为70%时，得率达到最大值，其后提取得率随着乙醇浓度的增加呈现下降的趋势。这种现象是由于魔芋本身含有多种极性不同的活性成分，提取溶剂极性的改变会对这些成分的提取有一定的影响。结合实验结果，选择70%的乙醇溶液为单因素实验中最佳提取溶剂。2.1.2 料液比对提取得率的影响准确称取五份魔芋粉（精确至0.0001g）于五支锥形瓶中，以70%的乙醇溶液为提取溶剂，分别以1:1、1:2、1:3、1:4、1:5的料液比，于60温度下超声20min，考察料液比对神经酰胺、生物碱提取率的影响，如图3所示：图3 料液比对提取得率的影响Fig. 3Effect of the Ratio of Solid to Liquid on Extraction Content由图可知，提取得率随着料液比的增大而提高，料液比为1:4时，提取得率达到最大值，其后则有所降低。这种现象是由于料液比增大即提取溶剂增多时会更充分的将有效成分提取出来，但当提取溶剂过多时，也会使更多的粗纤维类的物质溶出，从而阻碍了有效成分的提取。此外，过多的溶剂也会降低超声波的效率。结合实验结果，选择1:4为单因素实验的最佳料液比。2.1.3超声提取时间对提取得率的影响准确称取五份魔芋粉（精确至0.0001g）于五支锥形瓶中，以70%的乙醇溶液为提取溶剂，料液比1:4，于60温度下分别超声10min、15min、20min、25min、30min，考察超声时间对神经酰胺、生物碱提取得率的影响，如图4所示：图4 超声提取时间对提取得率的影响Fig. 4Effect of the Ultrasonic Extraction Time on Extraction Content由图可知，提取得率随着超声时间的延长而增大，超声提取时间为20min时，提取得率达到最大值，其后则随着时间的延长提取得率有所下降。这种现象是由于提取时间越长提取越充分，但如果超声时间过长，则会使魔芋中的一些小分子物质溶出，从而抑制有效成分的提取。从工业角度来说，适当的缩短超声时间也可以节能。结合实验结果，选择20min为单因素实验中的最佳提取时间。2.1.4超声提取温度对提取得率的影响准确称取五份魔芋粉（精确至0.0001g）于五支锥形瓶中，以70%的乙醇溶液为提取溶剂，料液比1:4，分别于40、50、60、70、80温度下超声20min，考察提取温度对神经酰胺、生物碱提取得率的影响，如图5所示：图5提取温度对提取得率的影响Fig. 5Effect of the Extractive Temperature on Extraction Content由图可知，提取得率随着提取温度的提升而增大，提取温度为60时，提取率达到最大值，其后提取率则随着温度的持续上升而下降。这种现象是由于超声波具有很强的空化作用和机械作用，温度较高时会破坏溶出的有效成分的结构，也使得乙醇大量挥发影响提取效果。结合实验结果，选择60为单因素实验中的最佳提取温度。2.1.5 提取级数对提取得率的影响准确称取五份魔芋粉（精确至0.0001g）于五支锥形瓶中，以70%的乙醇溶液为提取溶剂，料液比1:4，于60温度下超声20min，分别提取一次、两次、三次、四次，考察提取级数对神经酰胺、生物碱提取得率的影响，如图6所示：图6提取级数对提取得率的影响Fig. 6 Effect of Microwave Number of Times on Extraction Content由图可知，随着提取次数的增加提取得率逐渐增大，当提取级数大于3次时，提取得率增大的幅度变缓，为了节省原料及能源，降低生产成本，应适当控制提取级数。结合实验结果，选择3次为单因素实验中的最佳提取级数。2.2正交实验神经酰胺和生物碱的正交实验结果分别如表2，3所示。表2 神经酰胺的正交实验结果Tab.2 Orthogonal Experimenr and Range Analysis Results of Ceramides实验号ABCD提取率/%111117.01212229.603133311.00421235.38522315.62623129.36731328.40832138.169332111.2K127.6120.7924.5323.83_K220.3623.3826.1827.36_K327.7631.5625.0224.54_k19.206.938.187.95_k26.797.808.739.12_k39.2510.528.348.18_R2.463.590.551.17_因素主次2143优水平A3B3C2D2结果数据显示：在所选的四个因素中，其影响神经酰胺提取效果的程度大小为：料液比（B）乙醇浓度（A）提取时间（D）提取温度（C）；最佳提取工艺为：A3B3C2D2，即70%乙醇、料液比1:4、提取温度60、提取时间20min，提取级数3次，在此条件下提取率最高可达15.75%，大于正交设计中的结果。表3 生物碱的正交实验结果Tab.3 Orthogonal Experimenr and Range Analysis Results of Alkaloids实验号ABCD提取率/%111110.029212220.029313330.037421230.028522310.029623120.027731320.028832130.028933210.040K10.0950.0860.0840.098_K20.0850.0870.0980.085_K30.0960.100.0940.093_k10.0320.0290.0280.033_k20.0280.0290.0330.028_k30.0320.0350.0310.031_R0.0040.0060.0050.005_因素主次4123优水平A3B3C2D1由单因素实验、正交实验结果显示：在所选的四个因素中，其影响生物碱提取效果的程度大小为：料液比（B）提取温度（C）提取时间（D）乙醇浓度（A）；最佳提取工艺为：A3B3C2D1，即70%乙醇、料液比1:4、提取温度60、提取时间15min，提取级数3次，在此条件下提取率最高可达0.04137%，大于正交设计中的结果。综上所述，魔芋联产工艺中，神经酰胺与生物碱类化合物的最佳提取时间不同，考虑到单因素的实验结果，最佳提取工艺条件确定为：70%乙醇、料液比1:4、提取温度60、提取时间20min，提取级数3次。2.3 魔芋中活性成分的联产分离工艺准确称取600g魔芋粉，以1:4的料液比加入70%的乙醇溶液，于60恒温水浴内超声20min，提取三次，将提取液合并浓缩至一定体积，用石油醚萃取，水层保存，石油醚层浓缩得神经酰胺粗提物。用少量石油醚溶解，以体积分数分别为95:5、85:15、75:25、65:35、55:45、45:55的石油醚/乙酸乙酯的洗脱液各100mL进行梯度洗脱，控制洗脱剂1d/s的流速，进行硅胶柱柱层层析，用试管分别收集不同颜色的洗脱液，用薄层色谱法检测神经酰胺的存在，神经酰胺主要集中在75：25这个梯度下的流份中，合并含有神经酰胺的溶液，浓缩，进行二次柱层层析，收集含有神经酰胺的溶液，任其自然蒸发结晶。晶体用丙酮溶解，加入适量活性炭脱色，趁热过滤，滤液冷却至室温后低温4放置，进行重结晶，得白色透明晶体，得率为0.047%，纯度为80.77%。经石油醚萃取后的水层，减压浓缩至一定体积，加入3.0mol/L H2SO4调节溶液pH为2.0 3.0，离心，固体保存（检测不含黄酮类化合物），取上清液，加氨水调pH10，氯仿萃取三次（氯仿的用量依次为浓缩液的1/2、1/3、1/4），合并氯仿液，经旋转蒸发仪浓缩并于真空干燥箱中干燥，得黄褐色生物碱类提取物，用少量乙酸乙酯溶解，以体积分数分别为100:1、95:5、85:15、75:25、65:35、55:45、45:55的石油醚/乙酸乙酯的洗脱液各100mL进行梯度洗脱，控制洗脱剂1d/s的流速，进行硅胶柱柱层层析，用试管分别收集不同颜色的洗脱液，检测生物碱的存在，合并含有生物碱的溶液，进行重结晶，得率为0.041%，纯度为71.68%。将经乙醇溶液提取之后的魔芋残渣干燥，准确称取5.000g，加50mL石油醚振荡脱脂，两次，于通风厨处自然挥发干燥，加入500ml蒸馏水，搅拌溶胀4h，加水稀释，离心，弃去残渣，取上清液，旋转蒸发浓缩至一定体积，加85%乙醇溶液，KGM析出，无水乙醇洗涤两次，丙酮洗涤两次（溶剂回收），置于真空冷冻干燥箱中干燥过夜，得KGM精品，得率为51.16%，纯度为93.86%。2.4联产工艺与单提的比较由联产工艺中确定的各成分的最佳提取条件和方法，对魔芋中的神经酰胺、生物碱和KGM进行直接提取，即单提，产率分别为0.057%、0.048%、58.96%，而联产工艺所得神经酰胺、生物碱和KGM的产率分别为0.047%、0.041%、51.16%。比较两者的得率说明，联产中的神经酰胺类、生物碱类和KGM类化合物的提取、纯化的条件是合理的，工艺是可行的。3 结论实验结果表明，采用联产工艺提取魔芋中活性成分，纯度可以达到70%以上。通过实验得到最佳提取工艺条件是：乙醇溶液70%，料液比1:4，温度60，超声提取时间20min，提取级数3次。与单提相比，联产工艺提取活性成分的产率和纯度并没有太大的影响。从总的效益来看，联产工艺不仅节约了原材料，一次工艺过程还可获得三种产品，联产更有利于提高魔芋的利用率和附加值。此外，从魔芋中提取神经酰胺、生物碱类化合物、葡甘聚糖的工艺设备简单，成本低廉，为社会化大生产带来了希望。参考文献：1 颜治, 刘勤晋. 魔芋葡甘聚糖的特性、保健