有机荧光探针最新研究进展.doc

综述现代仪器分析有机荧光探针最新研究进展徐绍彬（化学化工学院，1081109001）摘要 荧光探针是是一种极好的生物分子传感器,具备灵敏度高反应时间迅速等特点。近年来,随着生命科学的不断发展,荧光探针已经在蛋白质、核酸、细胞检测及免疫分析等方面发挥了重要作用。随着荧光探针的合成及应用技术的不断改进,人们对有机荧光化合物的认识和研究也不断深入,有机荧光探针的发展前景将越来越广阔。本文对最近几年国内外有机荧光探针的研究情况做一综述。关键词 BODIPY 荧光探针 染料 探针是一种能和某特异靶分子相互作用,实现对靶分子进行检测的分子,并要求相互作用后对被探测对象不产生或仅产生可忽略的干扰。荧光探针就是以荧光物质作为指示剂,并在一定波长光的激发下使指示剂产生荧光,通过检测所产生的荧光实现对被检测物质的定性或者定量分析。荧光分析方法灵敏度高,选择性好,试样量小,在分析化学,特别是在分子生物学、生物化学、医学等领域中有较广泛的应用。由于大多数生物分子本身无荧光或荧光较弱,检测灵敏度较差,人们用强荧光的标记试剂或荧光生成试剂对待测物进行标记或衍生,生成具有高荧光强度的共价或非共价结合的物质,使检出限大大降低,这就是荧光探针技术。荧光探针可有多种分类方法:按荧光波长可分为发射在紫外可见区的荧光探针和近红外区的荧光探针。按荧光探针用途不同可分为荧光标记试剂(fluorescent) 和荧光生成试剂(nuorlgenic)。按荧光探针物质本身的性质又可分为有机(包括稀土金属有机配合物) 荧光探针、量子点荧光探针、高分子荧光探针等。近年来随着生命科学的日益发展，大量的各式各样荧光探针被合成出来，人们对荧光探针技术的认识和研究也不断的深入。目前常用于合成荧光探针的染料有BODIPY、菁染料、噻嗪与噁嗪类染料、呫吨类染料等。本文将讨论最近三、四年的有机荧光探针的发展情况，并重点对基于BODIPY的有机荧光探针的合成及应用进行概述。1 BODIPY类二氟化硼2二吡咯甲烷(BODIPY) 是一类重要的有机荧光染料，由于其分子结构易于改性，近十年来研究人员合成了一系列的BODIPY衍生物，并在荧光探针技术上得到应用。这类荧光染料具有荧光量子产率高、摩尔吸光系数大、稳定性好、对pH、溶液极性不敏感等优点，因而在金属离子检测、PH值测定、DNA的标记及测序等方面得到重要应用。1.1基于BODIPY的金属离子荧光分子探针研究进展设计一种检测生理过程重要金属离子的荧光探针是非常活跃的领域，对金属离子探针的研究早在20世纪七八十年代就已开始，己经报道的探针分子成百上千。BODIPY类金属离子荧光探针的研究也陆续见诸报道，不少研究人员利用BODIPY荧光染料合成形形色色的金属离子荧光分子探针，使它代替了许多早期的荧光染料而应用在生物和化学分析方面。 2008年，Serdar Atilgan1 Serdar Atilgan, Tugba Ozdemir, and Engin U. Akkaya*,A Sensitive and Selective RatiometricNear IR Fluorescent Probe for Zinc Ions Based on the Distyryl-Bodipy Fluorophore Organic.letters 2008,vol.10,No.18,4065-4067.1 等人通过逐步法合成了一种高灵敏的锌离子荧光探针。这种新颖的双苯乙烯基取代的BODIPY衍生物结合锌离子以后，发射峰从730nm蓝移至680nm，因而可做为发射峰在近红外区域的水溶性荧光探针。TEG=-(CH2CH2O)3CH3图1.1.1 Synthesis of the Near IR Emitting, Water-Soluble DS-Bodipy-Based Chemosensor 4 荧光光谱实验中，该探针对锌离子表现高度的选择性，对钙（II）、钾（I）、钠（I）及镁（II）离子基本无响应，因而能够避免这些生物体内含量较多的离子干扰。 Wenwu Qin, Mukulesh Baruah2 Wenwu Qin, Mukulesh Baruah, Noel Boens*, Ratiometric, Fluorescent BODIPY Dye with Aza Crown Ether Functionality: Synthesis, Solvatochromism, and Metal Ion Complex Formation J. Phys. Chem. A 2008, 112, 610461142等人合成了含氮杂冠醚取代基的BODIPY衍生物，这种基于BODIPY的染料分子表现强烈的依赖溶剂的荧光发射特征：增加溶剂的极性将导致低的荧光量子产率和荧光寿命，并且最大荧光发射波长红移。将其与各种碱金属离子、碱土金属离子络合研究荧光光谱变化情况，发现该荧光探针对镁、钙、钡离子十分敏感。 图1.1.2 synthesis of BODIPY Dye with Aza Crown Ether FunctionalityXiaojun Peng3 Xiaojun Peng, jianjun Du,Jiangli Fan. .A selective fluorescent sensor for imaging Cd in living cells. Journal of the American Chemical Society. 2007,129(6):1500-15013研究组合成了一个能专识别Cd2+离子的荧光探针，该探针具有较好的细胞穿透性，并且首次被应用于活体细胞内Cd2+的检测，其机理为分内电荷转移机理(IcT)。探针的最大发射波长为656nm与Cd2+络合后蓝移至597nln，而Zn2+及其它金属离子没有干扰，结构如图所示图1.1.3 structure of a BODIPY-based probe for CdYufang Xu 和Xuhong Qian则根据PET机理设计合成另一种高选择性的镉离子荧光探针4 Tanyu Cheng, Yufang Xu,* Xuhong Qian.* A Highly Sensitive and Selective OFF-ON Fluorescent Sensor for Cadmium in Aqueous Solution and Living Cell. J. Am. Chem. Soc., Article ASAP4。探针分子本身在溶液中几乎无荧光，而且不易受PH的影响。Zn2+, Pb2+, Cr3+, Fe3+,Cu2+, Hg2+, Ag+, Ba2+, Mg2+, Co2+, Cs+, Na+, K+, Ca2+ 和 Ni2+的存在几乎不影响荧光发射广谱，对Cd2+展示出高度的选择性。图1.1.4 structure of a BODIPY-based probe for Cd2 MingjianYuan5 Mingjian Yuan,Yuliang Li，Junbo Li et al.A Colorimetric and Fluorometrie Dual-Modal Assay for Mereury Ion by a Molecule. Organie Letters. 2007，9(12): 2313-23165等设计了一个基于PET和ICT双重机理的Hg2+荧光探针，该探针包含有两个受体，分别以PET机理和ICT机理与Hg2+结合。加入Hg2+前荧光较弱，最大发射波长在668nm，而络合Hg2+后荧光增强超过7倍，最大发射波长蓝移到578nm，对Hg2+显示出良好的选择性和高度的敏感性。结构如图所示图1.1.5 the structure of a BODIPY-based probe for Hg2+ Xuhong Qian6 Jiaobing Wang and Xuhong Qian.A Series of Polyamide Receptor Based PET Fluorescen Sensor Molecules: Positively cooperative Hg2+ Ion Binding with High sensitivity. Organie Letters，2006，8(17):3721一37246等以BODIPY为荧光团，以聚酰胺为受体，合成一系列基于PET机理的Hg2+荧光探针，每个探针分子能够络合两个Hg2+，荧光增强显著，该系列探针拥有专一的选择性、高灵敏性以及良好的水溶性，也许是因为水溶性太好所以不能够透过细胞膜，未能做到在细胞内荧光成像。结构如图所示图1.1.6the structure of a BODIPY-base probe for Hg2+Engin U. Akkaya7 Ali Coskun, M. Deniz Yilmaz, and Engin U. Akkaya* Bis(2-pyridyl)-Substituted Boratriazaindacene as an NIR-Emitting Chemosensor for Hg(II) Org. Lett., 2007, 9 (4), 607-6097 合成了双吡啶基取代的BODIPY衍生物用于检测Hg2+，如图1.1.7。这种探针具有长波长发射与吸收光谱，对Hg2+有很好的选择性，Ba(II), Ca(II), Cd(II), Co(II), Fe(II), K(I), Li(I), Mn(II), Pb(II)基本无影响，Zn(II) ，Cu(II)有较小的干扰。图1.1.7 the structure of a BODIPY-base probe for Hg2+2005年， Ju young Yoon8 Xin Qi,EunJin Jun,LiXu,etal. New BODIPY Derivatives as OFF-ON Fluorescent Chemosensor And Fluorescent chemodosimeter for Cu2+ :cooperative selectivity Enhaneement toward Cu2+ Journal of organic Chemistry.2006，71(7):2881-28848设计合成了一个选择性良好的Cu2+探针，Cu2+与探针络合后，探针由酯水解成醇，荧光大大增强，实现了对Cu2+的专一选择性。同年，christoPher J.chang9 Li Zeng, Evan W.Miller. a selective turn-on fluoresent sencor for inaging copper in living cell Joumal of the Ameriean Chemical Soeiety, 2006,128(1):10-11.9设计合成了一个Cu+探针，并且实现了在活体细胞中成像，在生物应用中有重要的意义。分子结构如下图所示图1.1.8 the structure of a BODIPY-base probe for Cu2+ and Cu+1.2基于BODIPY的pH荧光分子探针的研究进展pH在许多体系扮演重要角色，因而测定pH具有重大的意义。目前测定pH的方法很多，荧pH荧光探针是其中一种重要手段。相较其他分析方法，pH荧光探针具有不破坏待测体系、高灵敏度的特性，故在细胞生物学、药物学、生物化学上应用广泛。近年来，人们合成了多种pH荧光探针。2005年，Mukulesh Baruah, Wenwu Qin10 Mukulesh Baruah, Wenwu Qin and Noel Boens* BODIPY-Based Hydroxyaryl Derivatives as Fluorescent pH Probes. J. Org. Chem. 2005, 70, 4152-415710等人合成了一系列BODIPY类pH荧光探针，结构如图2.1所示。该系列探针以BODIPY荧光染料为荧光团，选择酚类做为识别基团。文中通过改变染料不同位置上的取代基，影响酚轻基上的电子云密度，达到调节pKa值的目的，得到pKa值介于7.5一9.3的七个pH荧光探针。但是，酚类化合物的化学稳定性不好，在空气中容易被氧化变质，这使该系列探针的应用受到很大的限制。Xiaojun Peng 研究组设计合成了一个BODIPY类pH荧光探针11 Binchen Guo, Xiaojun Peng .Synthesis and spectral properties of new boron dipyrromethene dyes Dye sand Pigments.2007，73:206一210.11，该探针具有很好的化学稳定性，检测范围为pH7.6一9.4, 荧光强度随pH变化15倍之多，而且有很好的水溶性，结构如图1.2.2所示。2008年，该课题组又合成两种新式BODIPY类荧光探针12 Maozhong Tian , Xiaojun Peng. Fluorescent pH probes based on boron dipyrromethene dyes Dyes and Pigments xxx (2008) 1512，合成过程及结构如图1.2.3所示。两种探针的荧光强度随溶液酸性增加，分别变化3倍（pH8.70-4.93）和14倍（pH9.02-3.29）。 图1.2.1 BODIPY-based pH probes. 图1.2.2 图1.2.3 Synthesis of the BODIPY-based pH probes.1.3 基于BODIPY的染料的其它荧光探针目前以BODIPY染料为母体结构的荧光探针多数都是用于检测金属离子及pH的，但研究人员的兴趣不局限于此，近来利用BODIPY染料合成了一些可以对某些酸、酸根离子或氧化物响应的荧光探针。HClO在日常生活广泛存在，如次氯酸盐用作消毒剂或漂白剂。在医学上越来越多的证据表明HClO与一些人类疾病如神经衰弱、心血管疾病、关节炎有关，但由于缺乏灵敏的专一检测次氯酸的探针，次氯酸在这些疾病中的行为机制尚不十分清楚。Nagano的研究小组合成了一种红色荧光探针用于检测次氯酸13 Kenmoku, S.;Urano, Y.; Kojima, H.; Nagano, T. Development of a Highly Specific Rhodamine-Based Fluorescence Probe for Hypochlorous Acid and Its Application to Real-Time Imaging of Phagocytosis J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 73137318.13，但灵敏度尚需提高。Dan Yang14 Zhen-Ning Sun, Feng-Qin Liu，Dan Yang*,A Highly Specific BODIPY-Based Fluorescent Probe for the Detection of Hypochlorous Acid. Organic letters, 2008, vol.10,No.11,2171-217414 则使用BODIPY染料合成了一种具有高灵敏度和专一性的绿色荧光探针HKOCl-1检测次氯酸（图1.3.1），并且可用于细胞内成像。这种新型探针可做为研究生物组织内HClO的功能的有效工具。氰化物是最致命的毒药之一，有效的检测氰离子浓度是十分重要的。特别是氰化物在当今工业广泛的使用，对环境、人类的自身健康存在潜在威胁，寻找能够检测极低浓度氰离子的手段是有必要的。众多分析手段中，光学检测法由于其操作简单、成本低廉、快速响应的特点吸引了相当多的关注。Engin U. Akkaya15 Zeynep Ekmekci, M. Deniz Yilmaz,and Engin U. Akkaya* A Monostyryl-boradiazaindacene(BODIPY) Derivative as Colorimetric and Fluorescent Probe for Cyanide Ions Organic letters,2008,vol.10,No.3,461-46415 合成了一种BODIPY衍生物可以检测溶液中微摩尔浓度的氰离子。当溶液有氰离子存在时，这种结构简单的荧光探针的发射强度急剧下降，溶液颜色可逆的由红色变为蓝色。荧光探针的合成、结构及可能的作用机理如图3.2所示图1.3.1 Reaction of Probe HKOCl-1 with HOCl 图1.3.2 Structure and the Synthesis of the Chemosensor and Suggested Mechanism for ON-OFF Switching within the Presence of CN- IonsYoungkyu Do16 Jung Oh Huh, Youngkyu Do,* and Min Hyung Lee* A BODIPY-Borane Dyad for the Selective Complexation of Cyanide Ion. Organometallics ,2008, 27, 1022102516 将一种三取代硼烷同BODIPY结合制备了对氰离子具有高度选择性的荧光探针，由于高灵敏的荧光响应特点，可以检测到低于微摩尔浓度的氰离子的存在。 图1.3.3 Structure and the Synthesis of the Chemosensor and mechanismNO在人体生理学上具有重要的功能，它充当细胞内外的信使分子。但它十分不稳定且浓度低，在活体细胞内很难检测。Tetsuo Nagano17 Yu Gabe,Yasuteru Urano, Tetsuo Nagano*,Highly Sensitive Fluorescence Probes for Nitric Oxide Based on Boron Dipyrromethene ChromophoresRational Design ofPotentially Useful Bioimaging Fluorescence Probe J. Am. Chem. Soc., 2004, 126 (10), 3357-3367 17设计合成了一种基于BODIPY的高灵敏荧光探针DAMBO可用于检测NO。DAMBO分子本身几乎无荧光，遇到NO分子发生反应后，则发出强烈的荧光。但当PH大于7时，荧光强度显著下降。Tetsuo Nagano又在DAMBO结构引入二羧乙基，合成了不受PH影响的荧光探针DAMBOPH，有望在生理学上得到应用。图1.3.4 DAMBO的结构与反应机制 R=CH2CH2CO2H图1.3.5 DAMBOPH的结构硫醇是生物化学上一类重要物质。目前已合成出多种硫醇探针，但多数是在紫外光区域激发或者自身具有较强的背景荧光。Tetsuo Nagano在07年合成了一种新式基于BODIPY的硫醇探针18 Takuya Matsumoto,Yasuteru Urano,Tetsuo Nagano* A Thiol-Reactive Fluorescence ProbeBased on Donor-Excited Photoinduced Electron Transfer: Key Role of Ortho Substitution Org. Lett., 2007, 9 (17), 3375-337718，这种探针在可见光下激发，并且在没有硫醇分子存在时自身不发出荧光。其分子结构上含有马来酰亚胺取代基，这使得BODIPY自身的荧光被熄灭。当探针与硫醇反应后，则发出极强的荧光。 图1.3.6 structure of thiol-reactive probe and mechanismBODIPY衍生物自身也存在一些缺陷，比如水溶性不好，这对扩大BODIPY应用领域带来了限制。近两三年来对BODIPY染料的研究热点是设计和合成新的长波长BODIPY衍生物，并对光谱特征进行研究。如向BODIPY母体分子引入芳香基团,增加核心部分的刚性平面结构和改变取代基等来增加染料的发射波长。2 基于其它染料的荧光探针 菁染料应用广泛，是生物组织成像研究中重要的荧光标签。特别是三碳菁染料，其荧光发射峰及吸收峰处于近红外区域，尤适合应用于细胞内成像。Tetsuo Nagano19 Urano, Y.; Kamiya, M.; Kanda, K.; Ueno, T.; Hirose, K.; Nagano, T. Evolution of Fluorescein as a Platform for Finely Tunable Fluorescence Probes J.Am. Chem. Soc. 2005, 127, 4888-4894.19 研究小组于2005年合成了一系列基于三碳菁染料的荧光探针DACs用于检测NO分子，但这种NO探针的荧光易受染料的浓度、细胞内的环境因素影响，应用受到很大限制。随后该小组合成了氨基取代的三碳菁染料DIPCY作为Zn2+荧光探针20 Kazuki Kiyose, Hirotatsu Kojima, Yasuteru Urano, and Tetsuo Nagano. Development of a Ratiometric Fluorescent Zinc Ion Probe inNear-Infrared Region, Based on Tricarbocya