Noth2调控舌鳞癌干细胞的增殖、侵袭和迁移.doc

www.CRTER.org葛臻琼，等. Noth2调控舌鳞癌干细胞的增殖、侵袭和迁移Noth2调控舌鳞癌干细胞的增殖、侵袭和迁移葛臻琼1，闫恩利2，孙学蓉3，任雪梅2，肖 海4(六盘水市人民医院，1口腔科，3肿瘤科，贵州省六盘水市 553000；2郑州大学第二附属医院康复科，河南省郑州市 450000；4贵州医科大学天然药物资源优效利用重点实验室，贵州省贵阳市 550000)引用本文：葛臻琼，闫恩利，孙学蓉，任雪梅，肖海. Noth2调控舌鳞癌干细胞的增殖、侵袭和迁移J.中国组织工程研究，2016，20(45):6753-6759.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.45.010 ORCID: 0000-0003-2450-7271(葛臻琼)文章快速阅读：Notch2对舌鳞癌干细胞ALDHbr增殖、侵袭和迁移的影响葛臻琼，女，1964年生，贵州省六盘水市人，副教授，主要从事口腔肿瘤性干细胞性疾病研究。中图分类号:R394.2文献标识码: A文章编号:2095-4344(2016)45-06753-07稿件接受：2016-09-16通过脂质体转染Notch2 shRNA (sh-Notch2)构建Notch2沉默的ALDHbr细胞(实验组)，以转染sh-control的ALDHbr细胞为对照以流式细胞技术对其进行分选，采用免疫印迹检测Notch2在普通舌鳞癌肿瘤细胞ALDHlow和ALDHbr细胞中的表达水平采用无血清培养基培养舌鳞癌细胞株Tca8113，富集ALDHbr细胞结果表明，Notch2可促进ALDHbr细胞的增殖、侵袭和迁移，提示Notch2在舌鳞癌的发生与发展中起着重要作用，其可能成为治疗舌鳞癌的分子靶点48 h后检测ALDHbr细胞的增殖及Ki67蛋白表达；Transwell小室法检测两组细胞生物侵袭、迁移及基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9蛋白的表达 文题释义：Notch2：Notch蛋白家族不但参与细胞的增殖、分化、凋亡及器官发育，且在肿瘤的发生和发展中发挥着重要的作用。Notch2已被报道与多种肿瘤的发生与发展相关，但是其作用较为复杂。有研究报道其作为癌基因，促进癌症的发生和发展。然而也有研究报道其在一些肿瘤中是低表达的，对癌症起抑制作用。肿瘤干细胞：是肿瘤细胞内存在的一小部分具有干细胞特性的细胞，拥有无限增殖、自我更新和多系分化的能力。这些细胞可能能够驱动肿瘤的生长、传播和转移。治疗后残余的“肿瘤干细胞”因为放疗抗性及化疗耐药性等而难以被杀死，最终可能导致肿瘤复发。Notch2在舌鳞癌干细胞(ALDHbr)的表达量：显著增加，但其作用尚不明确。从舌鳞癌细胞株Tca8113中分离培养ALDHbr细胞，检测Notch2在普通舌鳞癌肿瘤细胞(ALDHlow)和ALDHbr细胞中的表达水平，证实Notch2在ALDHbr细胞中的表达水平确实明显高于其在ALDHlow细胞中的表达水平。通过脂质体转染构建Notch2沉默的舌鳞癌干细胞和对照细胞，然后检测Notch2对舌鳞癌干细胞增殖、侵袭和迁移的影响，发现Notch2促进舌鳞癌干细胞增殖、侵袭和迁移。Notch2对舌鳞癌干细胞具有促进作用，可作为治疗舌鳞癌的一个潜在靶点，也为以后深入研究Notch2对舌鳞癌干细胞和舌鳞癌生物学特性的影响奠定了基础。摘要背景：前期研究发现，Notch2在舌鳞癌干细胞ALDHbr中表达显著上调，但其具体的作用尚不明确。目的：分析Notch2对舌鳞癌干细胞ALDHbr增殖、侵袭和迁移的影响。方法：采用无血清培养基培养舌鳞癌细胞株Tca8113，富集ALDHbr细胞，以流式细胞技术对其进行分选，采用免疫印迹检测Notch2在普通舌鳞癌肿瘤细胞ALDHlow和ALDHbr细胞中的表达水平。通过脂质体转染Notch2 shRNA(sh-Notch2)构建Notch2沉默的ALDHbr细胞(实验组)，以转染sh-control的ALDHbr细胞为对照，48 h后检测ALDHbr细胞的增殖及Ki67蛋白表达；Transwell小室法检测两组细胞生物侵袭、迁移及基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9蛋白的表达。结果与结论：Notch2在ALDHbr细胞中的表达水平显著高于其在ALDHlow细胞中的表达水平(P 0.05)；实验组ALDHbr细胞的增殖能力、Ki67蛋白表达低于对照组(P 0.05)；实验组ALDHbr细胞的侵袭和迁移能力显著低于对照组(P 0.05)，基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9的表达水平显3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 著低于对照组(P 0.05)；结果表明，Notch2可促进ALDHbr细胞的增殖、侵袭和迁移，提示Notch2在舌鳞癌的发生与发展中起着重要作用，其可能成为治疗舌鳞癌的分子靶点。关键词：干细胞；肿瘤干细胞；舌鳞癌干细胞；Notch2；增殖；侵袭；迁移主题词：干细胞；肿瘤干细胞；细胞生物学；组织工程Notch2 regulates proliferation, invasion and migration of tongue squamous cell carcinoma stem cellsGe Zhen-qiong1, Yan En-li2, Sun Xue-rong3, Ren Xue-mei2, Xiao Hai4 (1Department of Stomatology, 3Department of Oncology, Peoples Hospital of Liu Pan Shui, Liupanshui 553000, Guizhou Province, China; 2Department of Rehabilitation, the Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450000, Henan Province, China; 4Key Laboratory of Natural Resources and Utilization of Natural Resources of Guizhou Medical University, Guiyang 550000, Guizhou Province, China)AbstractBACKGROUND: Previous studies have found that the expression of Notch2 is up-regulated in tongue squamous cell carcinoma (TSCC) stem cells, but the effect of Notch2 on TSCC remains unclear.OBJECTIVE: To explore the effect of Notch2 on the proliferation, invasion and migration of TSCC stem cells (ALDHbr).METHODS: ALDHbr cells were enriched and separated by fluorescence-activated cell sorting technique from Tca8113 cells cultured in using serum-free medium, and Notch2 expression in ordinary TSCC cells (ALDHlow) and ALDHbr cells was detected by western blot. The ALDHbr cells transfected with Notch2 shRNA (sh-Notch2) by liposome served as experimental group, and ALDHbr cells transfected with sh-control were as control group. The effects of Notch2 on the proliferation, invasion and migration of ALDHbr cells were detected by cell counting kit-8 kit and Transwell assay, respectively. In addition, the expression levels of Ki67, matrix metalloproteinases 2 and 9 protein in Notch2-silenced ALDHbr cells and control cells were detected by western blot.RESULTS AND CONCLUSION: The expression level of Notch2 in ALDHbr cells was significantly higher than that in ALDHlow cells (P 0.05). The ALDHbr cell proliferation ability and Ki67 protein expression in the experimental group were obviously lower than those in the control group (P 0.05). The ALDHbr cell invasion and migration abilities in the experimental group were significantly lower than those in the control group (P 0.05). The expression levels of matrix metalloproteinases 2 and 9 protein in the experimental group were obviously lower than those in the control group (P 0.05). All these results show that Notch2 can promote the proliferation, invasion and migration of ALDHbr cells, which suggests that Notch2 plays an important role in the occurrence and development of TSCC, and it may be a potential molecular target for the treatment of TSCC.Subject headings: Stem Cells; Neoplastic Stem Cells; Cell Biology; Tissue EngineeringGe Zhen-qiong, Associate professor, Department of Stomatology, Peoples Hospital of Liu Pan Shui, Liupanshui 553000, Guizhou Province, ChinaCite this article: Ge ZQ, Yan EL, Sun XR, Ren XM, Xiao H. Notch2 regulates proliferation, invasion and migration of tongue squamous cell carcinoma stem cells. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(45):6753-6759.6757ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction口腔颌面部鳞状细胞癌是全球范围内发病率较高的癌症，多发于亚洲地区。有调查报告指出，2008年全球新增口腔癌患者263 900人，而死于该病的人数超过10万1。舌癌是口腔颌面部常见的癌症，约占口腔癌的32.3%，居口腔癌首位，其98%以上为鳞状细胞癌2。舌鳞癌的发病机制尚不明确，推测可能涉及到多个基因的突变及表达异常3。目前主要采用手术联合放化疗来治疗舌鳞癌，治愈率高达60%4。但由于舌体活动比较频繁、供血充足，使舌鳞癌易发生早期颈淋巴结转移。有研究报道，发生颈淋巴结转移的舌鳞癌患者其预后较未发生颈淋巴结转移的患者明显差，颈淋巴结转移是导致舌鳞癌患者死亡的一个重要因素5-6。此外，中晚期舌鳞癌患者对放化疗不敏感，术后易复发，预后差，5年生存率较低，约为27%7-8。因此急需找到一个更有效的治疗措施来治疗该疾病。舌鳞癌的恶性进展是复杂的、非随机、多因素、多阶段的演变过程，多个关键基因的参与及调控是其形成与发展的分子基础9。近几年来，随着细胞生物学、分子生物学等学科的不断发展，基因治疗已成为对放化疗不敏感肿瘤患者进行治疗的新探索。到目前为止，多种癌基因与抑癌基因已经被研究4。与正常组织相比，肿瘤的发生是基于基因水平的癌基因过度表达和(或)抑癌基因表达减少，因此，可以通过失活癌基因或者复活抑癌基因来抑制肿瘤的生长，增强其对放化疗的敏感性，同时减少其复发和转移。近十几年来，随着对肿瘤研究的深入，学者们提出了肿瘤干细胞学说，认为在肿瘤细胞中存在一小群干细胞样的细胞，其大多处于相对静止状态，使其对放化疗不敏感，但其又具有无限增殖、自我更新和多系分化的能力，故在治愈一段时间或临床好转后，仍会出现肿瘤的转移与复发4。因此肿瘤干细胞被认为是肿瘤发生、复发和转移的根源。如果使肿瘤干细胞的癌基因失活或者重建抑癌基因的功能，将更有效的治疗癌症。Notch蛋白家族不但参与细胞的增殖、分化、凋亡及器官发育，且在肿瘤的发生和发展中发挥着重要的作用10-11。Notch2已被报道与多种肿瘤的发生与发展相关，但是其作用较为复杂4。有研究报道其作为癌基因，促进癌症的发生和发展4。然而也有研究报道其在一些肿瘤中是低表达的，对癌症起抑制作用4。邹波12利用醛脱氢酶作为标志物，富集得到高表达醛脱氢酶的舌鳞癌肿瘤干细胞(ALDHbr)，发现Notch2在ALDHbr细胞的表达水平显著高于其在醛脱氢酶低表达的普通肿瘤细胞(ALDHlow)中的表达水平，但是其具体的作用并不清楚。实验采用流式细胞分选技术从舌鳞癌细胞株Tca8113中分选出ALDHbr和ALDHlow细胞，检测Notch2蛋白在两种细胞中的表达水平，然后将Ntoch2 shRNA质粒转染至ALDHbr细胞中，观察Notch2蛋白表达抑制后对ALDHbr细胞增殖、侵袭和迁移的影响，为舌鳞癌的干细胞基因治疗提供线索和 依据。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 细胞分子生物学体外实验。1.2 时间及地点 实验于2014年6月至2015年3月在贵州医科大学天然药物资源优效利用重点实验室完成。1.3 材料 舌鳞癌细胞株Tca8113购自中科院上海细胞研究所；RPMI 1640培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)；胰酶、多聚甲醛、考马斯亮蓝(美国Sigma公司)；B27、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子(北京英格恩生物科技有限公司)；细胞裂解液、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂(上海碧云天生物技术有限公司)；Notch2 shRNA和shRNA对照(西安沃尔森生物技术有限公司)；细胞培养箱(北京福意电器有限公司)；Notch2抗体、Ki67抗体、MMP-2抗体、MPP-9抗体、GAPDH抗体、辣根过氧化物酶标记二抗(英国Abcam公司)；硝酸纤维素膜(北京博励阳生物医学技术发展有限公司)；电泳仪(北京六一仪器厂)；流式细胞仪(美国BectonDickinson公司)；Lipofectamine 2000转染试剂盒、CCK-8试剂盒(美国GeneCopoeia公司)；Matrigel基质胶(上海威奥生物科技有限公司)。1.4 实验方法 细胞培养：将液氮冻存的Tca8113细胞置于37 水浴中复苏，之后培养在含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，于37 、体积分数5%CO2细胞培养箱中培养。待生长至对数期时，用0.25%胰酶消化，收集细胞，700 r/min离心5 min，然后按12或13的比例进行传代培养。ALDHbr细胞的富集、检测和分选：有关ALDHbr细胞分选的实验方法依据先前的方法并做简单调整13。收集对数期的Tca8113细胞，用PBS清洗3次后，加入到含有4 mL无血清培养基(RPMI 1640 11；B27 150；表皮生长因子20 g/L 和碱性成纤维细胞生长因子 20 g/L)的50 cm2培养瓶中，于细胞培养箱中进行培养，每二三天换液1次，换液时用移液枪吸出培养瓶中的液体至离心管中，将离心管静放于培养箱中1 h，然后去除离心管上部2/3的上清液，剩余部分再加入到培养瓶中，再添加4 mL新鲜的无血清培养基继续培养。应用流式细胞仪检测培养第1，5，10，15，20，25，30天细胞中ALDHbr细胞的比例，并收集培养20 d细胞中的ALDHbr和ALDHlow细胞。免疫印迹检测：收集培养20 d细胞中的ALDHbr细胞，PBS清洗3次，然后加入到混合裂解液(细胞裂解液、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，3者体积配比10011)中裂解细胞，冰浴30 min后，10 000 r/min离心6 min，收集上清，BCA法测定蛋白浓度，取30 g总蛋白进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，SDS-PAGE凝胶的浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为8%，蛋白分离后，电转法将胶上的蛋白质转至硝酸纤维素膜，TBST洗涤，用5%脱脂牛奶室温封闭1.5 h，一抗孵育4 过夜，TBST洗涤4次，二抗室温孵育1.5 h，TBST洗涤4次后，用化学发光法(ECL)显色，然后进行X射线片曝光显影。细胞转染：将舌鳞癌干细胞ALDHbr以3105/孔的密度接种到6孔培养板中，过夜培养，然后严格依照Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书进行转染，分别将Ntoch2 shRNA(实验组)和sh-RNA(对照族)转染至ALDHbr细胞内，转染24 h后更换新鲜的培养基，48 h后用于后续的实验。细胞增殖能力检测：采用CCK-8试剂盒检测Notch2蛋白抑制后对ALDHbr细胞增殖能力的影响。取转染的两组ALDHbr细胞，以3104/孔的密度接种到加有RPMI 1640培养基(含体积分数10%胎牛血清)的96孔板中进行培养，48 h后，去除96孔板中的旧培养基，每孔添加110 L CCK-8与RPMI 1640培养基(含体积分数10%胎牛血清)按体积比110配制的混合培养液，置于37 培养箱避光孵育2 h。然后采用双波长法检测细胞的增殖能力，检测波长为450 nm，参比波长为650 nm，以A450/A650代表细胞活力，按照下列公式计算细胞的相对增殖率：细胞相对增殖率(%)=实验组细胞活力/对照组细胞活力100%。实验重复3次，每次设置5个复孔。此外还采用免疫印迹检测了两组细胞中增殖相关蛋白Ki67的表达水平。细胞侵袭和迁移活性检测：通过Transwell小室实验检测Notch2对ALDHbr细胞侵袭和迁移的影响(细胞迁移实验的步骤与侵袭实验的步骤相同，只是未加入Matrigel基质胶)。在接种细胞前1 d，在小室上室面的底部铺Matrigel基质胶，于37 放置水化基底膜，按照Transwell小室说明，将转染Ntoch2 shRNA和对照的ALDHbr细胞加入到无血清RPMI 1640培养基中，调整细胞浓度为1108 L-1，取100 L细胞悬浮液加入上室，下室加入600 L含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基。将侵袭小室置于37 、体积分数5%CO2细胞培养箱中进行培养，22 h后，用棉签轻轻擦去基质胶和上室内未侵袭的细胞，用40 g/L多聚甲醛进行固定，0.25%考马斯亮蓝染色，蒸馏水清洗后风干，于显微镜下进行观察，100倍视野下取5个视野计数穿过小室的细胞数，取平均值进行统计学分析。此外还采用免疫印迹检测了两组细胞中侵袭标志物基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9蛋白的表达水平。1.5 主要观察指标 培养不同时间，Tca8113细胞中ALDHbr细胞所占的比例；Notch2蛋白在ALDHbr和ALDHlow细胞中的表达水平；沉默Notch2对ALDHbr细胞增殖、侵袭和迁移的影响。1.6 统计学分析 采用GraphPad Prism 5软件进行统计学分析，实验结果用s表示。采用t 检验比较组间差异，P 0.05、P 0.01或P 0.001为差异有显著性意义。2 结果 Results 2.1 培养不同时间ALDHbr细胞所占的比例 通过无血清培养基培养舌鳞癌细胞株Tca8113来富集ALDHbr细胞，流式细胞仪检测发现，ALDHbr细胞比例随着无血清培养基培养时间的延长而逐渐增加，刚开始增加较为缓慢，培养15-20 d的短时间内，ALDHbr细胞所占比例迅速增加；20 d时，ALDHbr细胞所占比例最高，之后又逐渐降低。在无血清培养第1，5 ，10，15，20，25，30天的细胞中，ALDHbr细胞所占的比例分别为1.1%、2.5%、4.5%、10.1%、31.2%、26.7%和23.2%，见图1。这一发现表明无血清培养20 d是分选ALDHbr细胞的最佳时机。后续实验所用到的ALDHbr和ALDHlow细胞均为无血清培养20 d时所分选得到的。2.2 Notch2蛋白在ALDHbr中表达上调 通过免疫磁珠分选无血清培养20 d的舌鳞癌细胞株Tca8113得到了ALDHbr和ALDHlow细胞，为了证实Notch2在ALDHbr细胞中表达上调，执行了蛋白免疫印迹实验，结果显示Notch2蛋白在ALDHbr细胞的表达水平显著高于其在ALDHlow细胞中的表达水平，证实Notch2蛋白在ALDHbr细胞中的确表达上调，见图2。2.3 Notch2促进ALDHbr细胞增殖 为了探究Notch2对ALDHbr细胞增殖的影响，首先通过脂质体转染构建Notch2沉默的ALDHbr细胞和对照细胞，将这2种细胞置于含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养48 h，然后加入含有CCK-8的混合液，继续培养2 h，之后检测这两种细胞在450，650 nm的吸光度，参照公式计算这两种细胞的相对增殖能力，发现实验组细胞的相对增殖能力明显低于对照组，见图3A。此外，还采用免疫印迹检测这两组细胞中Ki67蛋白的表达水平，结果显示实验组细胞中Ki67蛋白的表达水平明显低于对照组，见图3B。这些结果表明Notch2促进ALDHbr细胞的增殖。2.4 Notch2促进ALDHbr细胞侵袭和迁移 为了探究Notch2对ALDHbr细胞侵袭和迁移的影响，采用Transwell小室实验检测了Notch2沉默ALDHbr细胞和对照细胞的侵袭和迁移能力。结果显示，实验组细胞的侵袭和迁移能力均显著低于对照组，见图4A，B。此外，还执行了蛋白43210a4030201000 d 5 d 10 d 15 d 20 d 25 d 30 d 35 dALDHbr细胞比例(%)Notch2蛋白相对表达水平Notch2GAPDHALDHlow ALDHbr ALDHlow ALDHbr 图1 舌鳞癌干细胞ALDHbr的表达曲线Figure 1 Expression curve of ALDHbr cells图注：培养15-20 d的短时间内，ALDHbr细胞所占比例迅速增加；20 d时，ALDHbr细胞所占比例最高，之后又逐渐降低。图2 Notch2在舌鳞癌干细胞ALDHbr和普通舌鳞癌肿瘤细胞ALDHlow中的表达Figure 2 The expression level of Notch2 in ALDHbr and ALDHlow cells图注：与ALDHlow比较，aP 0.01。C图3 Notch2对舌鳞癌干细胞ALDHbr增殖的影响Figure 3 The effect of Notch2 on ALDHbr cell proliferation图注：图中A为细胞相对增殖率，B、C为细胞中Ki67蛋白表达。与对照组比较，aP 0.05。B1.51.00.50A1.51.00.50Ki67蛋白相对表达水平GAPDH相对增殖率Ki67aa对照组 实验组对照组 实验组对照组 实验组实验组150100500P 0.05对照组基质金属蛋白酶21.51.00.50P 0.01CB150100500Aa对照组 实验组侵袭细胞数(%)对照组 实验组a迁移细胞数(%)相对表达水平基质金属蛋白酶2基质金属蛋白酶9GAPDH基质金属蛋白酶9对照组 实验组图4 Notch2对舌鳞癌干细胞ALDHbr侵袭和迁移的影响Figure 4 The effect of Notch2 on ALDHbr cell invasion and migration图注：图中A为细胞侵袭能力，B为细胞迁移能力，C为细胞基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9的表达。与对照组比较，aP 0.05。免疫印迹实验检测侵袭标志物蛋白基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9在这2种细胞中的表达水平，结果显示，基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9在实验组中的表达水平显著低于其在对照组中的表达水平，见图4C。这些结果表明，Notch2促进ALDHbr细胞的侵袭和迁移。3 讨论 Discussion舌鳞癌是口腔癌中最常见的恶性肿瘤之一，具有恶性程度高、生长快、浸润性强、易转移、预后差等一系列生物学行为。目前主要采用手术和放化疗对其进行治疗，尽管临床效果有所提高，但患者5年存活率一直徘徊在60%左右14-15。人们一直在寻找和探索新的有效的治疗方法，其中基因治疗已成为研究的热点。因为肿瘤发生究其根源是某些癌基因的激活和(或)抑癌基因的失活导致的，因此如果将激活的癌基因再次失活和(或)失活的抑癌基因重新恢复功能，那么将会更有效地抑制肿瘤的生长，增强其对放化疗的敏感性，同时减少肿瘤的复发和转移。肿瘤干细胞假说认为，在肿瘤内存在一小群细胞与肿瘤的发生、发展以及转移密切相关，它们与正常的组织干细胞具有类似的生物学特性，从而称为“肿瘤干细胞”16-17。迄今为止，已有多种肿瘤干细胞被分离出来，其性能也被广泛研究，证实了肿瘤干细胞的存在和其理论的合理性和可信性，例如乳腺癌干细胞、白血病干细胞、结肠癌干细胞、卵巢癌干细胞、胶质瘤干细胞等4。因此，如果将肿瘤干细胞中激活的癌基因再次失活和(或)失活的抑癌基因重新复活，那么将会更有效地治疗肿瘤。不同肿瘤干细胞的分离方法并不完全一致。在头颈部鳞癌中，利用醛脱氢酶作为标志物可以有效富集肿瘤干细胞ALDHbr，与ALDHlow细胞相比，ALDHbr对放化疗不敏感，能够以极少的数量在免疫缺陷小鼠体内成瘤，展现出肿瘤干细胞的性质4。在此研究中，也利用醛脱氢酶作为标志物来富集舌鳞癌肿瘤干细胞，发现无血清培养基培养20 d的Tca8113细胞中具有最高比例的ALDHbr细胞。Notch2被报道在舌鳞癌干细胞ALDHbr中表达上调12。Notch2是一个与多种肿瘤发生与发展相关的蛋白，但是其作用备受争议。Baumgart等18报道Notch2沉默增强了非小细胞肺癌细胞系在免疫缺陷小鼠体内的成瘤能力。杨春秀等19发现，Notch2过表达抑制慢性粒细胞白血病细胞株K562细胞的增殖，并研究了其机制，发现其可能是通过上调NF-和BTGF-1基因表达及下调Bcl-2基因表达，将细胞阻滞于G1期来实现的。金晓燕等20发现Notch2 mRNA及蛋白在甲状腺乳头状癌组织中表达均下调，在甲状腺癌发生、发展中起抑癌作用。Notch2也被发现在上皮性卵巢癌中低表达，而且与肿瘤组织亚型相关21。丁永军等22报道Notch2在喉癌组织和细胞系中表达上调，在喉癌的发生、发展中起致癌作用。牛华涛等23报道Notch2在宣威女性肺癌组织中表达异常升高，并且其表达水平与患者的临床分期、分化程度及淋巴结转移等密切相关。Notch2通过诱导Cox-2的表达促胃癌的发展24。研究中再次检测Notch2在ALDHbr和ALDHlow细胞中的表达水平，证实Notch2在ALDHbr细胞的表达水平确实显著高于其在ALDHlow细胞中的表达水平。此外，对Notch2在舌鳞癌干细胞中的作用进行了研究，发现Notch2促进舌鳞癌干细胞的增殖、侵袭和迁移。综上所述，研究通过无血清培养基富集、流式细胞分选得到舌鳞癌干细胞ALDHbr，并证实Notch2在ALDHbr中表达上调，此外检测Notch2对ALDHbr细胞增殖、侵袭和迁移的影响，还进一步检测了增殖标志物Ki67蛋白及侵袭标志物蛋白基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9的表达25-34，发现Notch2促进ALDHbr细胞增殖、侵袭和迁移。这些发现揭示了Notch2与舌鳞癌的发生与发展有关，可作为舌鳞癌的一个潜在治疗靶点，但其作用机制还需要更加深入的研究。作者贡献：葛臻琼进行实验实施、数据统计及最终成文与修改，闫恩利负责试剂提供，孙学蓉和任雪梅负责实验设计，葛臻琼和肖海对实施，肖海对实验进行评估。利益冲突：所有作者共同认可文章内容不涉及相关利益冲突。伦理问题：没有与相关伦理道德冲突的内容。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。作者声明：第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。4 参考文献 References1 Jemal A,Bray F,Center MM,et al.Global cancer statistics. 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