果酒酵母的分离、纯化及选育(实验报告定稿).doc

一、引言酿酒酵母细胞透明，呈圆形或椭圆形，形体比较大，一般为 712m，含有转化酶能将葡萄汁中的糖转化成乙醇、二氧化碳和其它代谢产物。优良纯种酵母应具备下列性能：（1）除酿酒水果本身的果香外，酵母也应产生良好的果香与酒香。（2）生长速度快，有较高的发酵能力，能将糖分全部发酵完。（3）具有较高的抗S02能力，有较好的凝集力和较快的沉降速度。（4）培养基成分简单，来源广泛，价格低廉，对温度，pH，离子强度，溶氧等环境因素不敏感。（5）能在低温或果酒适宜温度下发酵，以保持果香和新鲜清爽的口味。由此可见， 酵母的品质对果酒的产量和质量影响很大。要获得优良的酿酒酵母，必须对其进行分离选育。果酒酵母的筛选应从相应的果品及其种植环境中采样分离，如成熟果实的表皮、自然腐烂发酵的果肉或果汁和果园的土壤等相关场所。根据实践经验，在果汁和自然发酵的果酒醪液中检出率较高，因为它们的基质环境与酿酒环境很相似。为使我们需要的酵母易于检出，应对采集的样品进行富集培养，通过设置较高的酒精浓度、添加SO2 、调整pH 等手段抑制不需要的微生物的生长，使希望检出的微生物得到增殖 。酵母检出后，应对其的发酵性能进行考察，包括酵母的一系列生理生化特性和风味物质形成的能力等，这些可通过作生理生化实验和三角瓶小型发酵实验分析和测定。二、实验仪器与材料样品：新鲜苹果（未经清洗）榨汁。YEPD 培养基（富集培养基）: 蛋白胨20g，葡萄糖20g，酵母膏10g，蒸馏水定容至1000ml. （每次根据需要量按如此比例配置，下同） PDA培养基（酿酒酵母培养基） ：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水定容至1000ml.（马铃薯去皮，切成块煮沸后再煮30分钟，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂溶化后定容至1000 ml。121灭菌30分钟。）PYG培养基（菌种保藏培养基）：蛋白胨3.5g，葡萄糖15g，酵母膏1.5g，KH2PO42.0 g，MgSO47H2O1.0 g，（NH4）2 SO41.0 g，琼脂20g，蒸馏水定容至1000ml.试剂：亚硫酸钠、乙醇，碘液，无菌生理盐水等。器具：三角烧瓶(250 mL)、无菌试管、无菌吸管(1 mL及5 mL)、无菌滴管、接种环、冰箱、酒精喷灯、冰箱、玻璃涂棒，血细胞计数板，显微镜，磁力搅拌器，台式离心机，震荡混合器等。三、实验方法与步骤酵母菌在自然界中存在的范围非常广泛，可以从不同的陆地或海洋生物环境中分离得到。在成熟水果的果皮、果梗上存在的酵母种类十分丰富，可针对不同水果原料分离出适合其自身特点的酿酒用酵母菌。1酵母菌的分离初筛1）菌种采样样品土壤叶片果实（带柄）腐果瓜根际土壤藤下方土壤垄间隙土壤采集方法用无菌小铲清去表层石块露出土壤后，戴好无菌手套取500g左右的土样装入无菌袋内。用无菌剪刀剪取不同生长阶段的叶片装入无菌袋内。用无菌剪刀摘取不同龄期的甜瓜（幼龄期，膨大期，成熟期）分别装入无菌袋内。用无菌剪刀摘取腐烂的果实装入无菌袋内。随机选择三块样地采样，每样采三份，将采集到的样品迅速保存在低温箱内(冰块降温)。2）富集培养与纯种分离方法：配制YEPD培养基分装于100ml三角瓶内每瓶50ml高温灭菌冷却，然后分别取适量样品（土样1g，果皮5g ，果柄若干，叶片若干）各三份接种，120r/min，28摇床培养4天。将富集培养液用接种环划线接种在PDA培养基上，每个样品接三个平板，28恒温培养。待菌种长出小菌落，镜检为酵母菌后，将其挑取于PDA平板划线并标号后28恒温培养。待再次长出单菌落后，挑取划线于PDA培养基上，28恒温培养。菌种划线三到四次后基本纯化。2酵母菌种的复筛以无琼脂PDA培养液作为复筛培养基。将初选菌种接入保藏培养基。培养24 h后每支斜面接入三角瓶培养，置于23-25 的培养箱中培养，测定其发酵水平及产香水平，选育出优良健壮、耐性强的适合果酒发酵的酵母菌种。发酵力试验：采用CO2失重法，取100 mL 三角瓶(已经烘干、称重)，各加入80 mL无琼脂PDA培养液，置于80的水浴杀菌5min，冷却到30后，按每升接种30 mL的比例分别接入酵母种子液，在20 下发酵。发酵过程中每24h 测定1次CO2 损失量，每次测定时，摇晃瓶子，以排出CO2。随着发酵时间的延续，瓶重逐渐减轻， 直到减轻量不高于0.2 g，即表示发酵结束，以CO2失重量为纵坐标，发酵时间为横坐标，绘制发酵力曲线，并确定菌株发酵力的强弱。3酵母菌的耐受性试验采用杜氏管发酵法测定所筛选的酵母菌对乙醇（4%、6%、8% ）、二氧化硫（20、40、60 mg/L）的耐性。将酵母菌分别接入含不同浓度的乙醇和不同浓度SO2的果汁培养基中，在相同条件下培养，观察杜氏管中气泡产生情况，重复3 次。活化条件：28 条件下，将纯种分离的菌种接种在PDA培养基培养48h发酵条件：28条件下，水果原汁培养基中静止发酵4 d；接种量：1107 cfu/mL（各菌种浓度在同一数量级即可）。1）耐酒精度试验按下表在试管中加入培养液。然后加入杜氏小管倒置使其充满果汁，塞好棉塞，115 20min灭菌。灭菌完后，待试管温度为常温后按下表加入酒精，加完后摇匀。最后在每个编号试管中接入对数期酵母1107个，28静止培养。观察产气情况，选出耐酒度比较好的菌种。将标签贴于各试管上，标4、6、8，按下表每管加入各量：试管编号01#2#3#95%酒精/mL00.420.630.84果汁/mL109.589.379.16培养液含酒精%（v/v）04682） 耐SO2试验按亚硫酸含量为6% 计， 计算出20、40、60 mg/L浓度所需的量，分别加入到培养液中制成SO 2 不同浓度系列的液体培养基。按下表加入培养液，然后加入杜氏小管倒置使其充满果汁，塞好棉塞，115 20min灭菌。灭菌完后，待试管温度常温后按上表加亚硫酸（科密欧试剂SO2含量6%），加完后摇匀。最后在每发酵管中接入对数期酵母1107个，28静止培养。观察产气情况，选出耐SO 2比较好的菌种。将标签贴于各试管上，标1、2、3、4、5，按下表每管加入果汁量：试管编号0123亚硫酸/uL03.36.710果汁/mL10101010培养液含SO2mg/L0204060四、实验结果1）发酵力测定2）耐酒精度性质测定乙醇浓度（%）产气时间（d）A菌B菌C菌2-44-+-6-+-81012141618202224-+-+- -+2-64-6-81012141618202224-+-+-+-+2-84-6-81012141618202224-+-+-+-3）耐SO2浓度测定SO2浓度（mg/L）产气时间（h） A菌B菌C菌 6-8+-2010+-12+14+16+18202224+6-8+-4010+-12-+14+16-+18202224+-+-6-8+-6010+12-+14+16+1820-+22+24+五、结论1）发酵力实验 如上，个发酵液整体失重走势相同，过程有个回升现象是由于在第4天测定前开盖放气且其他时间均未开盖放气的结果，应该是氧气含量的增加使得发酵增强，且发酵液中还生长有好氧细菌，所以导致空白对照也上升。从图可以看出，前期A菌属于优势发酵菌，后期B菌成为优势发酵菌，发酵力强，C菌则发酵力最弱。2）耐酒精性质实验见上图，在设定的梯度上，随着酒精度的增加，酵母菌产气量降低，说明一定浓度酒精抑制其生长。还可以看出，B菌耐酒精度较好，但C菌在