应用霉菌进行甾体11α-羟基化反应研究现状.doc

应用霉菌进行甾体11-羟基化反应研究现状罗敏,潘立0 引言自1952年美国普强药厂的Murray和Peterson首次利用黑根霉将黄体酮转化为11羟基黄体酮1，人们开始认识到甾体微生物转化在甾体药物生产中的重要性。几种重要的甾体微生物转化反应如羟化，脱氢成为工业上生产甾体激素及其类似物的重要手段，其中最重要的也是研究最为广泛的反应是甾体的微生物羟基化反应2。本文主要概述应用霉菌进行甾体11-羟基化反应研究现状。1 催化甾体11-羟基化反应的微生物能够催化甾体11-羟基化反应的微生物有很多，其中主要为霉菌如：黑根霉，少根根霉，黄曲霉，赭曲霉等3,4，而放线菌、棒状杆菌和诺卡氏菌等，虽然对于孕酮等甾体化合物也可进行11-羟基化，但同时也形成另一种降解反应，或者将甾体母核进行降解5。所以在应用霉菌催化甾体11-羟基化反应的过程中，需要避免出现由于污染杂菌而对甾体11-羟基化的影响。2 羟基化反应机理微生物催化羟基化反应是通过一种细胞色素P450依赖的金属酶实现的，统称为P450酶系。P450酶系存在于细菌中、真核细胞线粒体膜上以及结合在真核细胞的内质网上，羟基化反应则使用的是真核细胞线粒体膜上P450酶系中的单加氧酶活性6，之所以被定义为单加氧酶，是由于这些酶能够将一摩尔分子氧直接引入底物，经研究证明羟基化反应中的氧不是来自于水中,而是直接来自空气中的氧7。羟基化反应方程如下：R-H + 2NAD(P)H+ O2 R-OH + 2NADP+ + H2O其具体过程如下：第一步：底物结合到活性位点上，反应进行释放出1mol的水，形成一个配基给游离P450上的血红素铁原子。第二步：细胞色素的氧化还原部分（通常是NADPH或NADH）还原铁离子。第三步：一个氧原子的结合上去分开临近3价铁离子的位点，并释放一个不稳定的O2-。第四步：O2-与周围溶剂中的质子作用形成一个水分子，并留下一个活性氧原子。第五步：活性氧原子与底物分子反应，在底物上加上羟基。这整个循环反应通常在110sec内完成。 11-羟基化反应属于羟基化反应之一，只是由于菌种选择的不同以及底物的不同而出现的特殊位点的羟基化反应，不同微生物羟基化反应位点不同，部分转化反应参见表1。表1 工业中重要的甾体药物微生物转化反应羟基化反应菌种名称7串珠镰刀菌，布拉克须霉11赭曲霉，烟曲霉，黑根霉，金龟子绿僵霉15雷斯青霉16产玫瑰色链霉菌6耐热性芽孢杆菌11玉米弯孢霉15巨大芽孢杆菌3 甾体微生物11-羟基化反应的研究甾体微生物11-羟基化反应包括两个阶段：一是微生物菌体的培养阶段；二是添加底物的转化阶段，这两个阶段是具有连续性的，是影响甾体11-羟基化反应的重点，也是目前研究最多的方向。3.1 菌种选择及菌株选育能够催化甾体11-羟基化的霉菌种类有很多，常见的有黑根霉，赭曲霉，黄曲霉和金龟子绿僵霉等，其中黑根霉研究和使用的较多，相比于其他的霉菌而言，它的优势在于不产生色素，而色素的产生往往影响到产物的分离纯化，不产色素就大大简化了后期对目的产品的分离纯化。赭曲霉，黄曲霉也常常作为生产或实验目的菌种，针对它们往往会通过菌株选育的方法，筛选出一些缺陷型且转化率较高的菌株。对于菌种的选择及菌株的选育目的只有两个，一是要获得对于甾体11-羟基化反应能力强的微生物，二是要获得副产物少的微生物，换言之就是目的产物得率高的菌株。3.2 11-羟化酶活由微生物介导的酶催化反应中，广义的酶活包含两个层面：一是指单位数量的酶所能够催化反应的能力，二是指在相同的培养空间内所含有的酶的数量。酶活和上述两个方面均成正比关系。11-羟化酶为诱导酶，而诱导酶的底物诱导浓度为0.05%或稍高5；杨灿宇，杜连祥应用黄曲霉对甾体进行11-羟基化过程中，在菌体培养18小时后加入0.06%的底物诱导显示出明显的诱导作用，提高了11-羟化酶活8。需要注意的是，甾体作为诱导剂如果过早加入到菌体中，不仅起不到诱导的作用，反而还会影响菌体的生长，所以在大部分研究报道中，诱导剂加入一般选择在菌体生长对数后期，这样既保证了菌体的生长，又能够在菌体代谢旺盛，生命力最强的时期有效的诱导出大量的11-羟化酶。3.3 接种量在培养条件相同的情况下，霉菌菌体形态与接种量有直接的关系，接种量太低，霉菌菌体生长慢，菌丝体量少，则转化率低，同时还增加污染杂菌的机会；接种量太大，则会导致霉菌菌体过于旺盛，菌丝体结合紧密，影响菌体与底物的接触和溶氧的传递，且后期发生自溶，影响转化率，因此许多的研究中都包含有对于接种量的研究9,10,11,12。3.4 11-羟基化反应条件3.4.1 培养基组成培养基为微生物的生长、繁殖和代谢提供碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水等营养物质。在工业发酵领域中，培养基的组分显著的影响着发酵产物的浓度、转化率和生产强度，其成本也直接影响着整个发酵过程的经济利益。同时，培养基的组分也影响下游工艺中产品的分离提取的难易程度和成本。3.4.1.1 碳源碳源在培养阶段是作为微生物细胞结构的营养物质，而在转化阶段（羟基化阶段）则是能够起到提供营养、维持底物运输的活力和酶活力再生的作用13。许多研究已经表明碳源的添加对于转化率具有一定的影响。对于羟化反应的霉菌来说碳源主要有：葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、糊精、麦芽糖等等14,15，其中葡萄了的应用最广泛，也是被认为最为理想的碳源的存在。3.4.1.2 氮源氮源主要用于构成菌体细胞物质和含氮代谢物，并影响酶的生成，可以看出无论是培养阶段或者是转化阶段，氮源和碳源共同都对转化率有一定的影响。在工业上由于要考虑到使用成本的问题，所以玉米浆、蛋白胨、大豆蛋白水解物等氮源凭着其价格较低，现已被广泛使用。3.4.1.3 无机盐无机盐是微生物生长必不可少的营养物质，它们参与细胞结构构成，并与能量转移，细胞代谢调节有关。培养基中无机盐的种类和比例也会不同程度的影响羟基化反应的结果。据报道16显示在羟化过程的培养基中加入锰，镁等离子对于底物转化有刺激作用。也有研究认为对于11-羟基化来说，镁离子、磷酸根离子是必须的17,18,19。3.5 反应条件3.5.1 溶氧浓度催化甾体11-羟基化反应的霉菌均为好氧菌，其转化过程也是好氧过程且氧原子完全又空气中的O2提供，所以在菌体生长和转化过程中充足的溶氧是培养的关键，一般来说低水平的溶氧（15%）利于酶的诱导，较高的（30%）利于酶的的表达和底物的羟基化20。由于霉菌菌丝体的缘故，溶氧电极很难准确测出发酵液中的溶氧浓度，所以通常都是在保持罐压和机械搅拌速度的情况下，通过调整通气量来控制发酵液中的溶氧浓度，但是通过上述内容，我们认为从菌体培养直至添加酶诱导剂阶段的溶氧需求与底物羟化阶段的溶氧需求不同。3.5.2 pH值pH值对于羟基化的影响主要表现在菌体的生长方面和酶的催化方面，但是由于菌种和羟基化位点的不同，在羟基化的研究报道中最适pH值都是不太一致的，甚至在同一过程中培养阶段和转化阶段的pH值都不太一致，大致范围在4.0-7.0，过酸或者过碱对羟化反应都不利21,22,23。即使是羟基化位点相同，不同的菌株不同的底物，其最适pH值也不相同，例如：牟晓然等在利用赭曲霉11-羟基化坎利酮的研究中发现，将pH始终控制在6.7时转化率最高；而周浩力等在利用黑根霉11-羟基化沃氏氧化物的研究中发现，将pH始终控制在4.3时转化率最高。3.5.3反应温度羟基化反应与温度是有密切关系的，霉菌类通常的最佳生长温度一般在26-28，超过32就不会发生羟基化反应5,这应该是和P450酶系对温度及其敏感导致的，而在转化阶段的温度在不同的研究中往往不同，有的研究者将转化阶段的温度等同与培养阶段的最适温度，而有的研究者则选择转化阶段的温度不同与培养阶段的温度。3.5.4 搅拌速度搅拌速度影响到发酵体系中的溶氧、菌体、底物的分散情况，如果搅拌速度不够致使发酵体系中溶氧、底物、菌体不均匀，接触不充分，将不利于转化；而如果在培养早期使用较大的搅拌速度，由于剪切力的作用以及菌丝体初期比较脆弱，则会影响到菌丝体的生长，同样不利于转化。所以在甾体羟化反应的过程中，在菌体培养阶段通常使用较为温和的搅拌方式，搅拌速度比较低，而在转化的过程中则会采用相对较高的搅拌速度。3.6 菌体生长曲线菌体生长曲线能够显示出菌体在不同时间所处的生长时期，在微生物发酵中该项参数是重中之重，在11-羟基化反应中也是如此，根据生长曲线可以准确的判断出各级培养的截止时间，以及开始进行酶诱导时间，其对于发酵的影响详见3.2和3.3。不同的菌株之间的生长曲线都有可能不同，在这个参数上的判断不能够按照经验或者常规来简单判断，必须结合实际生产设备和环境进行实际考察。3.7 底物溶解甾体累底物的水溶性很差，而11-羟基化酶为胞内酶，因此整个生物转化过程可分为酶促反应（即扩散进入细胞的底物分子在酶催化作用下转化为产物）和扩散（包括底物颗粒的溶解，底物分子向细胞内扩散和产物分子向细胞外扩散）两部分24，其中，底物溶解被认为是该过程的控制步骤。底物的溶解现在研究的比较多其中常见的方式主要有两种：一种是通过添加有机溶剂和表面活性剂的方法，增加底物的溶解性，但是往往使用的有机溶剂对于菌体本身的毒害比较大，例如DMF虽然能够有效的提高底物的溶解性，但是其对于菌体的毒害作用也同时存在，针对不同底物选择不同的有机溶剂和表面活性剂的组合，既要能够有效的提高底物的溶解性又要减少其对菌体的毒害，成为该方法的重点；另一种方法是应用超声处理底物，超声处理能够有效的降低颗粒尺寸，增强混合，促进传质25。现在也有研究26将超声处理和有机溶剂相结合，以及将超声处理延伸至对菌体进行处理，以提高菌体细胞的通透性方面。4 结语对于应用霉菌进行11-羟基化反映研究，我们认为需要重点把握的关键点有两个：一是使用的菌种和菌株，选择酶活强，转化率高的菌种菌株是进行11-羟基化的根本；二是对于目的菌株的生长曲线的把握，这有利于对于整个反应过程的控制，比如种子转罐的时机，诱导剂添加的时机，底物添加的时机等等。而在上述文章中所提到的例如培养基的组成、过程控制（温度，pH，溶氧）都必须要基于前两个关键点。本公司现在所进行的11羟项目在上述两个关键点上所进行实验研究工作还有待进一步深入，而其他的过程控制参数多数来自于小试和理论推算，这与实际大生产需求还相差甚远，但是我们相信在结合公司自身的实验和生产条件的基础上，能够针对上诉问题进行相关升入的实验研究，无论是从转化率上，还是从投料量上均有突破的可能。1Murray H C, Peterson D H, Eppstein S H, et al. Microbiological transformations of steroids. I introduction of oxygen at carbon-11 of progesteroneJ. J. Am Chem Soc, 1952, 74:5933.2茅燕勇，毛斌，范伟平. 固定化赭曲霉NG0216细胞羚基化坎利酮J. 生物加工过程. 2005，3(2):45-49.3徐诗伟，徐清，法幼华. 甾体1,4-脱氢和11-羟基化反应的两种不同微生物转化J.生物工程学报，2000，16(5):651-653.4Femandes P, Cruz A, Angelova B, et a1, Microbial Conversion of Steroid Compounds: Recent DevelopmentsJ. Enzyme and Microbial Technology, 2003, 32(6):688-705.5郭一平，郑璞. 甾体微生物C11-羟化反应的研究进展J.浙江工业大学学报，2004，32(4):437-441.6Lenasi H, Hudnik-Plevnik T, Identification and Partial Characterization of Cytosolic Progesterone-Binding Sites in the Filamentous Fungus Rhizopus nigricansJ. Archives of Biochemistry an Biophysics, 1996, 330(1):80-86.7Peterson J A, Graham S E, A close Family Resemblance:the Importance of Structure in Understanding Cytochrome P450, Structure.1998,6(9):1079-1085.8杨灿宇，杜连祥. 甾体C11-羟化菌株AF9612发酵条件的研究J.天津轻工业学院学报，1999，1:10-14.9Whitaker A., Long P.A. Proc, Biochiem, 1973, 66:27-31.10Metz B., Kossen N.W.F. Biotechnal. Bioeng, 1977, 19:781-799.11Braun S., Vecht-Lifshitz S.E. TIBTECH, 1991, 9:63-68.12赵金玉，杜连祥. 深层培养中赭曲霉菌球对坎利酮11羟化反应影响的研究J. 工业微生物，2007，37(3):20-22.13HAMDALLAH HAFEZ-ZEDAN. ROSEAIRE PLOURDE Spore Plate Method for Transformation of Steroids by Fungal Spore Entrapped in Silica Gel GJ. APPLIED MICROBIOLOGY 1972, 21(5):815-819.14赵金玉，杜连祥. 深层培养中赭曲霉菌球催化坎利酮11羟基化反应条件的研究J. 天津科技大学学报，2006，27(3):8-11.15杜大庆，刘玲玲. 黑根霉对甾体C11羟基化反应J. 河南工业大学学报，2006，27(3):70-74.16 Sukhodolskaya G.V, Angelova B A, Koshcheenko K A. Physiological and Biochemical Peculiarities of the Curvularia Lunata BKM F-644 Culture, Capable of 11-hydroxylation of Steroid Substrates, Prikladnaya Biokhimiya I Mikrobiologiya, 1986, 22(2):226-237.17 俞俊棠. 生物工艺学下册M. 上海华东化工学院出版.1992年18JOSEPH J.GOODMAN 16-Hydroxy Steroids X 1.2,3-and 16-Hydroxylation of 9-Fluorohydrocortisone by Strains of Streptomyces roseochromogenesJ. Appl.Microbiol 1961.19项昭保，戴传云. 核黄素生理生化特征及其功能J. 食品研究与开发，2004，25(6):90-95.20Clark T A, Chong R, Maddox I S. The effect of dissoloved oxygen tension on 11 and 19 hydroxylation of Reichsteins substabce by pellicularia filamentosaJ.Appl Microbio Biotechnol 1982, 14(3):131-135.21Micr P.Fernandes, A.Cruz, B.Angelova, H.M.Pinheiro. Mi