第4章-利用生物合成原理寻找微生物新药.ppt

第四章微生物药物的生物合成微生物新药的发现 根据微生物药物的生物合成原理发现微生物新药的方法和途径 通过非基因定向改变 基因定向改变 以及组合生物催化的技术 或是改变原有微生物药物的生物合成途径 或是对原有的微生物药物 或先导化合物和中间体 进行生物催化 以发现微生物新药 微生物药物生物合成与微生物新药发现的基本途径 通过非基因定向改变的方法包括 定向生物合成 杂交生物合成 突变生物合成 以及生物转化与组合生物转化 基因定向改变 即为组合生物合成 第一节生物合成途径的非基因定向改变与微生物新药的发现 一 非遗传操作的定向生物合成与微生物新药的发现 已有的研究表明 在抗生素等次级代谢产物生物合成中酶 底物的特异性足以使结构相关的代谢产物在其发酵液中积累 但由于生物合成酶的底物专一性较低 宽泛性 其野生型菌株或阻断突变株的发酵过程中添加一些已知结构类似物作为前体物质 可以产生含有与这种已知结构类似的新衍生物 这种获得新次级代谢产物的途径 可以被称之为非遗传操作的定向生物合成 directedbiosynthesis 前体 precursor 即在微生物培养过程中 外源添加的某一化学物质 通过微生物的代谢 能够将其整体地或部分地整合到某一特定的次级代谢产物的分子中去的化合物 如苯乙酸或苯乙酰胺及苯氧乙酸等 非遗传操作的定向生物合成 这种在发酵过程中通过添加某种特定的前体物质 使微生物的生物合成朝着将这些前体物质掺入到产物分子的某一特定部位而产生过量的含有这种前体的产物的方法 即为非遗传操作的定向生物合成 其基本原理是由于参与这些反应的生物合成酶的底物专一性较差 而能使外源添加的某些前体物质竞争性地掺入到特定产物的分子中去 定向生物合成与微生物新药的发现 次级代谢产物合成酶的特点 是一个由一系列酶参与催化的多酶体系 参与催化反应的酶的底物专一性比初级代谢合成酶要差 应用实例 应用非遗传操作定向生物合成的方法能够制备获得许多新的抗生素 其中目前已进行工业化生产的有 青霉素G和V 培罗霉素 四环素和金霉素等 青霉素定向生物合成 培罗霉素定向生物合成 培罗霉素定向生物合成 可结合进入BLM的末端胺基部分的非天然胺基化合物 四环类抗生素的定向生物合成 微生物发酵产生的一些四环素类抗生素 四环类抗生素的定向生物合成 在生产金霉素时需添加氯化物作为前体 而当生产四环素时 则必须要在发酵培养基中添加氯离子抑制剂 如溴化物或M 促进剂等 从而抑制金霉素的合成而得到四环素产物 另外 用金色链霉菌在发酵的金霉素过程中添加适量的甲基化反应抑制剂如磺胺嘧啶钠 能够获得去甲基金霉素 杜拉克丁的定向生物合成 杜拉克丁的定向生物合成 非基因改变定向生物合成的研究进展 尽管近年来基因改变的定向生物合成发展很快 但利用非遗传操作定向生物合成原理寻找新的生理活性物质的研究还在不少实验室继续进行 特别是对一些肽类如环孢菌素A aureobasidins及糖肽类如替考拉宁产生菌的定向生物合成研究取得了很大的进展 二 添加外源酶抑制剂的杂交生物合成与微生物新药的发现 杂交生物全成 hybridbiosynthesis 似乎可以理解为是一种 强化 的非遗传定向生物合成 如在苦霉素产生菌生酵过程中添加聚乙酰途径中 酮酯酰基合成酶抑制剂 线兰菌素 cerulenin 使其失去合成链霉素大环内酯苷元 picronolide 的能力而只能合成糖基 同时在发酵过程中添加泰乐菌素大环内酯苷元 protylonolide 使其与苦霉素生产菌产生的糖基结合 得到一种被称之为M4365G1的杂合抗生素 hybridantibiotic 杂交生物合成与微生物新药的发现 杂交生物合成产物工业化的可能性 尽管通过杂交生物合成能够得到一些新的抗生素 但由于所添加的浅蓝菌素本身就是一种昂贵的抗生素 再则所添加的苷元的结构受到限制 所以这种方法似乎没有很大的实际意义 三 非定向诱变的突变生物合成与微生物新药的发现 突变生物合成 mutationalbiosynthesis 突变生物合成是指野生型产生菌经化学或物理等因素诱变处理后 丧失合成原来次级代谢产物的能力而成为阻断突变株 然后在发酵培养阻断突变株时添加某种外源物质 参与生物合成以获得新的次级代谢产物的过程 另外 突变生物合成也包括由于突变而引起产生新的次级代谢产物 突变生物合成原理 阻断突变株的类型 营养缺陷型突变株 由于编码菌体生长之必须的酶的基因发生了突变 而使菌体不能生长 导致不能合成次级代谢产物 因此 这类突变株也可以称为初级代谢阻断突变株 独需型突变株 这种突变株的生长和初级代谢正常 但由于编码次级代谢产物合成的某一基因发生突变 而使丧失了合成次级代谢产物的能力 这是突变生物合成所需要的突变株 双重阻断突变株 即突变既发生在编码初级代谢酶的基因上 也发生在编码次级代谢酶的基因上 突变生物合成与微生物新药发现 突变生物合成的基本流程 突变生物合成产生的新抗生素 红霉素生物合成途径 突变株产生的新蒽环类抗生素 突变株产生的一些新的次级代谢产物 我国应用突变生物合成原理找到的小诺霉素 四 原生质体融合与微生物新药的发现 微生物原生质体融合 即是指将双新株的微生物细胞分别通过酶解脱壁 使之形成原生质体 然后在高渗溶液的条件下混合 并加入物理的 如电融合 或化学的 如聚乙二醇 或生物的 如仙台病毒 助融条件 使双亲株的原生质发生相互凝集 通过细胞质融合 核融合 尔后发生基因组间的交换 重组 进而可以在适宜的条件下再生出微生物细胞壁 获得重组子的过程 四 原生质体融合与微生物新药的发现 利用微生物厚生质融合寻找新抗生素的基本原理是来源于两种已知产生不同抗生素的产生菌的融合子 有可能将它们的部分生物合成基因整合在一起而产生新的杂合抗生素 另一个原理是由于抗生素产生菌中存在着沈默基因 当这些沉默基因受到外源物质刺激后 有可能被激活而产生 结构与亲株完全不同的新的抗生素 四 原生质体融合与微生物新药的发现 应用这种方法获得的第一个新抗生素是吲哚佐霉素 indloizomycin 其亲株为链霉素产生菌灰色霉菌和天神霉素 istamycin 产生菌天神链霉菌S tenjimariensis 目前的报道较少 第二节生物合成途径的基因定向改变与微生物新药的发现 组合生物合成Combinatorialbiosynthesis 是一种通过对天然产物生物合成途径中的基因进行中断 置换及重组等操作 改变原来抗生素产生菌或其他天然产物产生菌生物合成代谢产物的途径 产生具有新颖结构的 非天然的天然杂合产物 unnaturalnaturalhybridcompounds 的技术或方法 组合生物合成的潜能potential 重组 组合 互补 替换R 可利用的基因 n 基因的等位形式化合物数 RnR 4 n 4Compounds 44 256 组合生物合成的原理 生物合成酶基因的结构和组成生物合成酶基因的特异性及底物宽容性生物合成酶基因之间的相互作用生物合成途径的研究基础 一 具有聚酮体生物合成途径的微生物药物产生菌的组合生物合成 基于商业性的原因 迄今为止 对一些具有聚酮体生物合成 polyketidesynthases PKSs 途径的 天然产物 如红霉素 阿维菌素 泰乐菌素 柔红霉素 阿克拉霉素 西罗莫司和利福霉素等 具PKS途径的抗生素 1 红霉素产生菌的组合生物合成 通过操作PKS的模块中单个基因的组合生物合成 在非天然产物产生菌中过量表达组合生物合成产物 通过操作PKS模块之间连接的组合生物合成 通过操作脱氧糖途径基因的组合生物合成 红霉素产生菌的组合生物合成的可能性 参与红霉素生物合成的PKSs 或6 脱氧红霉内酯合成酶 6 deoxyerythronolideBsynthase DEBS 有6个模块组成 每个模块负责合成聚酮体中的一部分 由于各模块之间的协调性 以及每个模块编码决定延伸单位的选择 功能和立体化学性质的催化结构域 因此 就有可能通过对PKSs结构域或模块的操作获得具有新颖结构的化合物 由于具有聚酮体结构的化合物其结构非常复杂和具有众多的立体异构体 因而 难以用常规的化学方法来获得 红霉素的生物合成途径 PKS中的每一个模块的组成 酮基合成酶 ketosynthase KS 酰基转移酶 acyltransferase AT 酰基载体蛋白 acylcarrierprotein ACP 酮基修饰酶 包括酮基还原酶 ketoreductase KR 脱氢酶 dehydrogenase DH 和烯酰还原酶 enoylreductase ER DEBS含有编码三个独立的多肽亚单位的6个模块大多数典型的聚酮体合成途径的产物包括对PKS产物的修饰 如将脱氧糖或氨基糖进行糖苷化以及通过细胞色素P450进行氧化 图中所示的LD为装载域 loadingdomains TE为硫酯酶 esterases 1 通过操作PKS的模块中单个基因的组合生物合成 一是用利福霉素PKS模块2中的DH ER KR结构域取代红霉素PKS模块2中的KR 二是将模块5中的KR缺失 三是用利福霉素模块2中的丙二酰 特异性AT取代模块6中的甲基丙二酰 特异性的AT 将得到一个发生三重突变的PKS产物 2 在非天然产物产生菌中过量表达组合生物合成产物 将E coli开发成能够表达PKS产物需要解决的问题主要有三个方面 一是能够功能性表达巨大的蛋白 330kDa 二是PKS亚单位的ACP结构域的翻译后磷酸泛酰巯基乙胺酰化 三是聚酮体途径中的前体物质 特别是 2S 甲基丙二酰 CoA在E coli中不存在 Pfeifer等的工作包括 运用来源于枯草芽孢杆菌非核糖体多肽合成酶 NRPS 基因簇的磷酸泛酰巯基乙胺酰转移酶 phosphopantetheinyltransferase 基因sfp 以对PKS亚单位的ACP结构域的翻译后磷酸泛酰巯基乙胺酰化 过量表达E coli中的丙酰 CoA合成酶基因prpE 扰乱丙酰 CoA代谢途径 以及过量表达来自S coelicolar的丙酰 CoA羧化酶基因pcc 使丙酰 CoA转化为 2S 甲基丙二酰 CoA 3 通过操作PKS模块之间连接的组合生物合成 通过对DEBS模块在E coli和体外的表达研究 发现在PKS装配过程中那些短的模块内和多肽内的 连接件 是至关重要的成分 研究发现在相继非共价连接的模块中 其氨基和羧基末端存在有多肽内连接件 这种连接件与单个多肽内的模块之间的连接件不同 因此 使用一种合适的连接件就有可能允许杂合的模块之间进行功能性连接 a 已经鉴定了不同的模块内和多肽内的连接件 并由此指导合成模块之间的聚酮体中间体 这里需要合适的氨基和羧基末端连接配对 以产生功能性连接模块 b 在构建功能性互补体时 可以使用编码来源于不同微生物多个模块的全亚基 如图所示 来源于苦霉素 picromycin 的PKS PikAI和PikAII 与来源于竹桃霉素 oleandomycin 的PKS OleA3 相结合 4 通过操作脱氧糖途径基因的组合生物合成 对已经发现的由自然界中植物 真菌和细菌产生的很多具有生理活性的糖苷类化合物的分析发现 连接在苷元上的糖基的结构大多为6 脱氧己糖 6 deoxyhexoses 6DOHs 据统计 这些具有生理活性的糖苷类化合物的结构上含有70多种不同的6 脱氧己糖 由放线菌产生的具有不同生理活性的糖苷化合物的结构特性 具有单糖残基的化合物 红霉素A 柔红霉素 urdamycinA和rebeccamycin 具有双糖残基的化合物 光辉霉素 mithramycin 具有三糖残基的化合物 乌达霉素A urdamycinA 和光辉霉素 前者同时具有单糖和三糖残基 后者同时具有双糖和三糖残基 以O 糖苷键连接的化合物 红霉素A 光辉霉素 柔红霉素和乌达霉素A 以C 糖苷键连接的化合物 乌达霉素A 以N 糖苷键连接的化合物 rebeccamycin 由放线菌产生的具有不同生理活性的糖苷化合物的化学结构 a 通过将竹桃霉素产生菌S antibioticus中齐墩果糖基 转移酶基因在不同的S erythraea中的表达 得到了3 O 鼠李糖基红霉素和6 dEB衍生物 以及一个desosaminylatedtylactone b 改造来源于刺孢霉素 calicheamicin 产生菌的基因 可以得到一个新的脱氧氨基糖 并将其附着在S lividans产生的苷元上 c 在S lividans产生菌中构建desosamine的途径 然后导入通过遗传操作的DEBS 可以得到具有新颖结构的desosaminylated大环内酯类文库 将竹桃霉素产生菌抗生链霉菌中编码竹桃霉素oleandrose糖基转移酶的基因oleGII 该酶负责将相应的糖基转移到8 8a 脱氧竹桃内酯 8 8a deoxyoleandolide 的4 位羟基上 整合到红霉素产生菌eryBV缺失突变株中 eryBV基因编码的糖基转移酶负责将L mycarose糖基转移到6 脱氧红霉内酯 6 deoxyerythronolide 甙元的相同位置 并进行表达 结果得到了将天然糖基L rhamnose转移到6 脱氧红霉内酯4 位的新红霉素衍生物 其具有抗菌活性 将泰乐菌素产生菌弗氏链霉菌中编码mycaminose糖基转移到泰乐菌素甙元上的转移酶基因tylM2整合到红霉素产生菌三缺失突变株SGT2 分别缺失聚酮体合成酶基因 mycarose和desosamine糖基转移酶基因 但仍然具有合成L mycarose和D desosamine的能力 并使之表达 同时在培养过程中外源加入16 元环的泰乐酮 tylactone 结果得到一种新的泰乐星衍生物5 O desosaminyl tylactone 如图 所示 说明泰乐菌素产生菌中的转移酶TylM2能够识别和转移不同的氨基糖 这两个例子同时也表明抗生素糖基转移酶具有较宽的底物专一性 5 通过表达杂合基因方法的组合生物合成 第一个例子是应用有些大环内酯类抗生素3或4 位的羟基酰化酶基因 使某些大环内酯类抗生素在相应的位置酰化 1 异戊酰螺旋霉素 来自碳霉素的4 异戊酰辅酶A转移酶的carE基因 2 丙酰螺旋霉素 来自麦迪霉素的4 丙酰化酶的mpt基因 3 乙酰泰乐菌素等 来自碳霉素的3 O 乙酰转移酶的acyA基因 引入外源酶基因产生杂合抗生素 丙酰螺旋霉素基因工程菌构建图 必特螺旋霉素的结构 R1HR2COCH2CH CH3 2COCH3COCH2CH2CH3COCH2CH3COCH2CH3COCH3 2 蒽环类抗生素产生菌的组合生物合成 蒽环类抗生素是一类临床上非常重要的抗肿瘤抗生素 它们同样是PKS生物合成途径 因此 通过以下集中组合生物合成的方法 可以得到一系列 非天然的天然杂合化合物 1 通过破坏靶基因的组合生物合成 通过基因框内的诱变或缺失 或插入抗生素耐药基因盒的方法 可以将所选择的靶基因特异性地钝化 尽管靶基因的破坏可以得到新的化合物 但会出现错误的结果 这是因为一方面由于极性效应影响下游基因的表达 另一方面受到由于外源DNA片断的插入造成的反义RNA合成影响上游基因 1 通过破坏靶基因的组合生物合成 在光神霉素 mithramycin 产生菌S argillaceus中 破坏编码葡萄糖 1 磷酸 胸苷 5 三磷酸胸苷转移酶的基因mtmD后 获得了两个四环类的光神霉素衍生物 premithramycinone和4 脱甲基premithramycinone衍生物 Premithramycinone的抗肿瘤生物活性与光神霉素相似 且有趣的是其化学结构与来源于黑曲霉A niger的神经肽受体抑制剂BMS非常相似 如图所示 通过基因破坏后得到的两个光神霉素衍生物和BMS 192548 2 通过表达杂合基因方法的组合生物合成 来源于S fradiae的urdE基因 编码一种氧化酶 其可能涉及到将1分子氧引入到乌达霉素结构中 在控制启动子ermE的条件下 将其在丁省霉素C产生菌S glaucescens中表达 产生一种新的杂合化合物 6 羟基丁省霉素C 如图所示 通过将乌达霉素产生菌的urdE基因在丁省霉素C产生菌中表达 得到一种杂合产物6 羟基丁省霉素C 2 通过表达杂合基因方法的组合生物合成 另外一个实例是 将柔红霉素产生菌S peucetius中编码11 aklavinone 羟化酶的基因 dnrF 在阿克拉霉素产生菌S galilaeus中表达 结果得到了一种新的杂合化合物 11 羟基阿克拉霉素A 如图所示 这种羟基化的产物 其对白血病细胞和黑色素瘤细胞的生物活性比阿克拉霉素要强 杂合化合物11 羟基阿克拉霉素A的组合生物合成 2 通过表达杂合基因方法的组合生物合成 通过这种组合生物合成的方法 已经获得了数个杂合糖苷化的丁省霉素 如用含有一个完整埃罗霉素 elloramycin 基因簇 具有产生8 去甲基丁省霉素C的能力 的黏粒转化乌达霉素产生菌或光神霉素产生菌 可以得到四种新的糖苷化合物 齐墩果糖基 鼠李糖基 mycarosyl丁省霉素C和双齐墩果糖基丁省霉素C 如图所示 有趣的是 这些脱氧糖在乌达霉素和光神霉素苷元上的附着位置 与在埃罗霉素的附着位置不同 表明 这些聚酮体的糖基转移酶具有底物宽泛性 杂合糖苷化丁省霉素的组合生物合成 能够被ElmGT糖基转移酶转移的一些糖基和elloramycin甙元的结构 表柔红霉素和表阿霉素基因工程菌的构建 表柔红霉素和表阿霉素基因工程菌的构建 通过钝化dnmV基因 得到一个柔红霉素和阿霉素产生菌的阻断突变株 dnmV基因编码4 酮基还原酶 其与合成这类抗生素结构中的脱氧糖 柔毛霉胺的合成有关 分别将阿维菌素产生菌中编码合成齐墩果糖的基因avrE 以及红霉素产生菌中编码合成mycarose的基因eryBIV 克隆到dnmV基因阻断突变株中 由于重组工程菌中的外源基因表达的4 酮基还原酶的特性与柔红霉素产生菌中的4 酮基还原酶不同 前者具有非对映立体催化特性而能够形成L epidaunosamine 表柔毛霉氨 而突变株dnmV生物合成甙元的能力和合成糖基转移酶的能力仍然保持 且由于糖基转移酶的底物专一性较差而不影响将表柔毛霉氨连接在原来的蒽环酮上 从而得到4 表柔红霉素和4 表阿霉素 如图所示 表柔红霉素和表阿霉素基因工程菌的构建 二 具有非核糖体生物合成肽类途径的微生物药物产生菌的组合生物合成 具有非核糖体生物合成途径 noneribosomalpeptidesynthases NRPSs 的环肽或糖肽类 天然产物 如万古霉素 博莱霉素 环孢菌素A和埃坡霉素等进行了大量的研究工作 并取得了令人注目的成果 Chloroeremomycin生物合成 1 小分子准备在酶的催化下生成装配过程中需要的小分子化合物 对于万古霉素族糖肽类抗生素而言包括 非蛋白氨基酸和TDP L b epivancosamine 2 装配上步准备好的氨基酸通过腺苷化反应 adenylation 转换成为腺苷酸 而后与邻近肽载体蛋白 peptidecarrierprotein PCP 上的巯基形成硫酯 thiolation PCP之间的缩合功能域 condensation 催化肽键形成 经过几个延伸过程 最后TE域将完成的肽切下 有时过程中还会有差向异构作用 epimerisation 3 装配后修饰在这步反应中通常进行氧化反应和糖基化 对于有的化合物还存在N端甲基化反应 万古霉素的生物合成 另据研究 天然的万古霉素生物合成共有35步 其先以五种自由的氨基酸单体合成一线形的七肽 然后芳基边链在交联酶的催化下适时地组合 交联 形成复杂的七肽骨架 最后UDP glucose和UDP 4 epi vancosamine在糖基转移酶的作用下连接到七肽骨架上 万古霉素生物合成的五种起始自由氨基酸单体 万古霉素生物合成的逆向合成分析图 在万古霉素家族中发现的糖基 GtfE糖基转移酶识别并将UDP glucose转移至七肽骨架上 GtfD糖基转移酶识别并将4 epi vancosamine连接至万古霉素骨架上 2 糖肽类抗生素的组合生物合成的研究现状 糖肽类抗生素的组合生物合成主要有4条途经 第一 提供新的氨基酸单体 或者是利用已知生物合成途经中的酶来催化生成新的我们所需要的氨基酸单体 使合成新的七肽骨架 第二 改变七肽NRPS装配线上的基因 从而达到重新设计生物合成途经的目的 第三 在七肽装配之后 干预修饰酶 tailoring 作用的步骤 包括N 甲基化 酪氨酸的 羟化等 第四 利用糖基转移酶将不同结构的糖基与不同苷元连接以及连接不同的个数 从而产生具有不同生理活性的最终产物 因此糖苷化酶可以作为一种制备各种不同糖苷化合物的催化剂 有可能从中找到具有潜在应用价值的新活性物质 2 糖肽类抗生素的组合生物合成的研究现状 Solenberg等从万古霉素产生菌东方拟无枝酸菌C329 4中克隆到了两个糖基转移酶基因gtfE和gtfD 并从chloroeremomycin产生菌中克隆到了3个糖基转移酶基因gtfA gtfB和gtfC 将gtfB和gtfE在大肠埃希氏菌中表达 研究了其体外活性 结果表明当TDP 葡萄糖存在时 从大肠埃希氏菌中表达的糖基转移酶GtfB和GtfE能够在体外将葡萄糖转移到万古霉素糖苷上 从而得到中间体DVV desvancosaminylvancomycin 当底物换为UDP 葡萄糖 UDP D 木糖时 仍然能够转移到万古霉素糖苷上 GtfE也能够将TDP UDP 葡萄糖转移到无糖基化的化合物A47934和A41030上 而GtfB不能将化合物A47934糖基化 表明GtfE相对于GtfB底物特异性差 2 糖肽类抗生素的组合生物合成的研究现状 在Matsushima等建立地无糖基化合物A47934产生菌丰加链霉菌 Streptomycestoyocanesis 基因转移系统的基础上 Solenberg等还成功地将含有糖基转移酶基因gtfE的质粒导入到丰加链霉菌中 得到了糖基化的A47934衍生物 GtfE 和GtfB在体内进行的糖苷化反应 2 糖肽类抗生素的组合生物合成的研究现状 Losey等采用化学酶法合成了很多NDP 葡萄糖的类似物来研究GtfD和GtfE的催化活性 结果表明 GtfE不但能用UDP 葡萄糖类似物 TDP 葡萄糖类似物作为糖基供体 同时还可以采用脱氧葡萄糖类似物以及氨基在2 3 4 或6位的TDP UDP 葡萄糖类似物作为糖基供体 更值得注意的是 一般来讲GtfD将vancosamine连接至万古霉素的假糖苷的葡萄糖配基上 试验结果表明GtfD还可以将4 epi vancosamine连接至GtfE以不同的糖基供体为底物所催化生成的衍生物上 糖基化位点在2 脱氧的除外 这样产生的带有两个氨基糖的万古霉素衍生物就提供了一种新的结构 以便于继续进行类似于oritavancin的烷基化从而提高生物活性 2 糖肽类抗生素的组合生物合成的研究现状 Chen等从chloroeremomycin的生物合成基因簇中克隆到了L epivancosamine的合成基因 在大肠埃希氏菌中表达 并成功地在体外重建了从TDP 4 酮基 6 脱氧D 葡萄糖经过C 2脱氧合作用 deoxygenation C 3胺化 amination 甲基化 methylation C 4酮基还原 C 5表构异化等步骤得到了TDP L epivancosamine 这个糖基的基因克隆和表达为以后组合生物合成提