苏教版选修1 1.2 分离特定的微生物并测定其数量 课件（40张）.pptx

第二节分离特定的微生物并测定其数量 第一章无菌操作技术实践 用液体培养基分离 培养 用固体培养基分离 培养 二元培养物分离 培养 选择培养分离 单孢子分离 微生物分离方法 要分离微生物 必须根据它的特点 包括营养 生理 生长条件等 采用选择培养的方法 经过一定时间的培养后 使这种微生物在群落中的数量不断增加 在通过平板稀释法等进行纯培养分离 微生物纯种分离 将多种混杂微生物 经某种技术或方法分离成纯种的过程 纯培养 pureculture 在适宜条件下培养纯种获得的培养物 群体 单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长 繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的 有一定形态结构的子细胞群体 称为菌落 colony 菌落 一个菌落是一个纯种 也是一个纯培养 单个微生物只在固体培养基上形成菌落 在液体培养基中不会形成菌落 同一细菌在不同的培养平板上形成不同的特征菌落 菌落形态包括菌落的大小 形状 边缘 光泽 质地 颜色和透明程度等 每一种细菌在一定条件下形成固定的菌落特征 不同种或同种在不同的培养条件下 菌落特征是不同的 这些特征对菌种识别 鉴定有一定意义 微生物样品 多种混杂 某种方法 分散成单个微生物 平板 培养 单菌落 每个菌落为纯种 纯培养 单菌落转接培养 纯种 纯培养 微生物纯种分离的原理和方法 一 用固体培养基 营养琼脂平板 分离纯种 平板分离法 将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面 每个孤立的活微生物体经过生长 繁殖均可形成单个菌落 微生物接种方法常见的有 平板划线法和稀释涂布平板法 1 平板划线法通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作 将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面 2 稀释涂布平板法将菌液进行一系列的梯度稀释 然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养 在稀释度足够高的菌液里 聚集在一起的微生物将分散成单个细胞 从而能在培养基表面形成单个的菌落 稀释涂布平板法操作过程分两个步骤 即系列稀释操作和涂布平板操作 纯种平板分离的不同方法 从土壤中分离纯微生物 104 ml 103 ml 102 ml 101 ml 涂布平板法 稀释倒平板法 1 涂布平板法 spreadplatemethod 2 稀释倒平板法 倾注平板法 pourplatemethod 分区划线法 蛇形线法 操作图 第一区划线 灭菌接种环 第二区划线 灭菌接种环 第三区划线 灭菌接种环 3 平板划线法 streakplatemethod 分区划线法适用范围 适用于浓度较大的样品 连续划线法操作图 连续划线法适用范围 适用于浓度较小的样品 二 选择培养分离 创造适于目的微生物生长条件 原理 促使目的微生物快速生长呈优势菌 抑制非目的微生物生长 从混杂微生物中分离目的微生物 利用选择培养基进行直接分离 选择培养基只允许特定微生物生长 而同时抑制或阻止其他微生物生长的培养基 选择培养基 加入青霉素的培养基 分离酵母菌 霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基 分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基 分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基 分离自养型微生物加入四环素 卡那霉素等抗生素的培养基 分离导入了目的基因的受体细胞 可抑制细菌 放线菌细胞壁主要成分肽聚糖的合成 其细胞壁是由纤维素 几丁质 葡聚糖组成 1 尿素的利用 尿素是一种重要的农业氮肥 尿素不能直接被农作物吸收 土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用 2 细菌利用尿素的原因 土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 原理 培养基的氮源为尿素 只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素 以尿素作为氮源 缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素 缺乏氮源而不能生长发育繁殖 而受到抑制 所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物 一 筛选菌株 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基 从物理性质看此培养基属于哪类 从功能上属于哪类培养基 固体培养基 在此培养基中哪些作为碳源 氮源 碳源 葡萄糖 尿素氮源 尿素 选择培养基 1 显微镜直接计数 利用血球计数板 在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量 缺点 不能区分死菌与活菌 不适于对运动细菌的计数 二 统计菌落数目 计数板是一块特制的厚玻璃片 玻片上有四个槽构成三个平台 中央平台又由一短槽隔成两半 其上各刻有一小方格网 每个方格网共分九个大格 中央的一大格作为计数用 称为计数室 血球计数板计数室有两种刻度 1大格 16中格25 16 400小格 1大格 25中格16 25 400小格 计算公式 1 16格 25格的血球计数板计算公式 酵母细胞数 ml 100小格内酵母细胞个数 100 400 104 稀释倍数 2 25格x16格的血球计数板计算公式 酵母细胞数 ml 80小格内酵母细胞个数 80 400 104 稀释倍数 以计数酵母菌为例 1 用血球计数板计数酵母菌悬液的酵母菌个数 2 样品稀释的目的是便于酵母菌悬液的计数 以每小方格内含有4 5个酵母细胞为宜 一般稀释10倍即可 3 将血球计数板用擦镜纸擦净 在中央的计数室上加盖专用的厚玻片 4 将稀释后的酵母菌悬液 用吸管吸取一滴置于盖玻片的边缘 使菌液缓缓渗入 多余的菌液用吸水纸吸取 捎待片刻 使酵母菌全部沉降到血球计数室内 血球计数板的使用 5 计数时 如果使用16格 25格规格的计数室 要按对角线位 取左上 右上 左下 右下4个中格 即100个小格 的酵母菌数 如果规格为25格 16格的计数板 除了取其4个对角方位外 还需再数中央的一个中格 即80个小方格 的酵母菌数 6 当遇到位于大格线上的酵母菌 一般只计数大方格的上方和右方线上的酵母细胞 或只计数下方和左方线上的酵母细胞 7 对每个样品计数三次 取其平均值 按下列公式计算每1ml菌液中所含的酵母菌个数 1 常用方法 通过统计平板上的菌落数 就能推测出样品中大约含有多少活菌 2 原理 稀释涂布平板法 2 间接计数法 活菌计数法 一 土壤取样从肥沃 湿润的土壤中取样 先铲去表层土3cm左右 再取样 将样品装入事先准备好的信封中 取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌 二 制备培养基制备以尿素为唯一氮源的选择培养基 实验的具体操作 应在火焰旁称取土壤10g 在稀释土壤溶液的过程中 每一步都要在火焰旁进行 分离不同的微生物采用不同的稀释度原因 不同微生物在土壤中含量不同目的 保证获得菌落数在30 300之间 适于计数的平板 三 样品的稀释 四 取样涂布 实验时要对培养皿作好标记 注明培养基类型 培养时间 稀释度 培养物等 如果得到了2个或2个以上菌落数目在30 300的平板 则说明稀释操作比较成功 并能够进行菌落的计数 如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大 表明试验不精确 需要重新实验 注意事项 为了保证结果准确 一般选择菌落数在30 300的平板上进行计数 为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中 经涂布 培养计算出菌落平均数 统计的菌落往往比活菌的实际数目低 涂布平板法所选择的稀释度很重要 一般以三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在50个左右为最好 五 结果分析与评价1 通过对照实验 若培养物有杂菌污染 菌落数偏高 若培养物混入其他氮源 则菌落形态多样 菌落数偏高 难以选择出分解尿素的微生物 2 提示 选择每个平板上长有30 300个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适 同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊 如相差较大 表示实验不精确 课题延伸 能分解尿素的细菌的鉴定 鉴定的原理 细菌合成的脲酶将尿素分解成氨 会使培养基的ph升高 鉴定方法 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂 利用此培养基进行细菌培养 观察培养基的颜色变化 分解纤维素的微生物的分离 一 纤维素与纤维素酶 纤维素 一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物 广泛地存在于植物的根 茎 叶等器官中 纤维素酶 由微生物分泌的一种复合酶 包括c1酶 cx酶和葡萄糖苷酶 由于它们的协同作用 最终将纤维素分解成葡萄糖 刚果红染色法 刚果红能与纤维素形成红色复合物 而不与水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应 用加入刚果红的纤维素培养基去培养微生物时 如果培养基中出现以菌落为中心的透明圈时 可说明该菌落是纤维素分解菌 因为它已将被刚果红染成红色的纤维素分解了 原理 1 产生标准菌落的细菌的最初数目和培养基分别是 a 一个细菌 液体培养基b 许多细菌 液体培养基c 一个细菌 固体培养基d 许多细菌 固体培养基 c 随堂练习 2 有关涂布平板法的叙述错误的是 a 首先将菌液进行一系列的梯度稀释b 然后将不同稀释度的菌液分