家蚕基因的克隆、序列分析及其表达模式研究论文(pdf 6页).pdf

农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology2008 16 3 430 435 基金项目 国家重大基础研究发展规划 973 项目 No 2005CB121000 资助 通讯作者 Author for correspondence 研究员 博士生导师 主要从事家蚕功能基因组和蛋白质组学的研究 Tel 0511 88791923 E mail 收稿日期 2007 09 30 接受日期 2007 11 27 研究论文 家蚕 基因的克隆 序列分析及其表达模式 周红亮 陈克平 姚 勤 高 路 陈慧卿 申红星 赵国力 江苏大学生命科学研究院 镇江212013 摘要 采用荧光差异显示技术 从家蚕 对氟化物耐性品系 441和感性品系 440 中获得差异表达基因 B cell lymphoma lewkmia 2 GenBank No AB008449 含有 19 个外显子和 18 个内含子 剪切信号符合 GT AG 规则 BmBCL 2含有 965个氨基酸 分子量为 108 800 kD 等电点为 6 370 结构分析无 C 末端疏水跨膜结构 蛋白质同源性分析表 明 BmBCL 2属于BCL 2家族蛋白 具有调控细胞凋亡保守功能域 BH1 BH2 BH3和 BH4 RT PCR结果表明 清水对照处理 48 h 时 在家蚕耐氟品系441DZ和感性品系 440DZ五龄 5个组织均有表达 添氟处理时 在 441F中肠表达 水平明显高于440F品系 不添氟时 在 441DZ中肠表达丰度同样高于 440DZ 暗示 在家蚕抗性品系的高表达可能与 耐氟性有关 关键词 家蚕 氟化钠 荧光差异显示技术 生物信息学分析 表达模式 中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 1006 1304 2008 03 0430 06 Cloning Sequence Analysis and Expression Pattern of Gene in ZHOU Hong liang CHEN Ke ping YAO Qin GAO Lu CHEN Hui qing SHEN Hong xing ZHAO Guo li The fluorescent different display technique PCR FDD PCR was used to analysis differentially expressed gene in fluoride resistant silkworm strain 441 and susceptible strain 440 and a differentially expressed gene B cell lymphoma lewkmia 2 GenBank No AB008449 was obtained The contained 19 exons and 18 introns its splice sites conformed to GT AG rule The BmBCL 2 protein contained 965 amino acid with relative molecular mass 108 800 kD and isoelectric point 6 370 The protein had no hydrophobic transmembrane anchor region at the C terminus Protein analyses indicated that BmBCL 2 belonged to BCL 2 protein family which contained four evolutionarily conserved regions known as BH1 BH2 BH3 and BH4 RT PCR results showed that was expressed in five tissues of both 5th instar 441DZ and 440DZ 48 h post treatment with water When silkworm was treated with or without fluoride F the expression of in midguts was higher in 441F and 441DZ than in 440F and 440DZ respectively These results indicated that the high expression level of in resistant stain may be related with fluoride resistance fluoride FDD PCR bioinformatics analyses expression pattern 氟化物是造成环境污染和影响人类健康的重要 因素之一 过量的氟化物能引起 DNA 损伤 Zeiger 1993 Chen 2002 诱导细胞凋亡 Jing 1999 Hirano and Ando 1997 和改变细胞周期 Wang 2004 Ha 2004 目前研究表明 脂质过氧化作用是氟中毒的主要调控机制 Rzeuski 1998 Shivarajashankara 2001 在人类 Guo 2002 实验动物 Shanthakumari 2004 和培养细胞 Wang 2004 中 都已证明氟 中毒和脂质过氧化作用之间存在紧密的联系 然而 目前的研究多是从医学临床角度研究脊椎动物中毒 和解毒机理 用昆虫研究报道极少 氟中毒能引起家蚕脂质过氧化 吕顺霖和丁春 阳 2002 导致细胞的损伤 林昌麒等 1997 研究表 第 3 期 周红亮等 家蚕 基因的克隆 序列分析及其表达模式 明家蚕品种对氟化物污染忍耐性存在明显的差异 有耐氟主基因存在 并受其它基因的共同作用 生化 研究表明 家蚕经口添氟处理下 会引起体内一些基 因的表达水平和酶的活性的变化 例如血淋巴过氧 化物酶 谷胱甘肽过氧化物酶活性显著增强 这些抗 氧化酶类能有效地清除氟中毒家蚕组织细胞内的过 氧化氢 缓解氧化应激作用引起的细胞损伤 是有利 缓解氟中毒的一些酶类 可能与家蚕的耐氟性有关 吕顺霖等 2002 吴小锋等 1998 但是否有其它基 因参与解毒代谢过程的研究了解的很少 为了研究 与耐氟功能相关的基因 本实验通过荧光差异显示 fluorescent different display FDD 技术 在家蚕耐氟 品系 441 和敏感品系 440 中筛选差异表达基因 并 对该基因在抗性和感性品系组织中的表达模式 以 及对氟化物作用下表达量影响进行了测定 旨在探 讨该基因对氟诱导脂质过氧化引起的细胞异常凋亡 的保护作用 1 材料和方法 1 1 家蚕品系 从本实验室保存的家蚕 品种资 源中选择高耐氟化物品系 441 和敏感性品系 440 为 材料 按照常规方法饲养 在五龄起蚕时 用 200 mg L氟化钠浸泡处理 5 min 的桑叶 对 440 和 441 在五龄幼虫饷食时 经口添食 命名为 440F 和 441F 同时对两个品系用添食清水做对照 分别命 名为 440DZ和 441DZ 一日 3 次 添食 24 h 1 2 取材与组织总 RNA 提取 经口添食 200 mg L 氟化钠处理桑叶 48 h 后 分别对各品系取 5 头蚕的中肠 脂肪体 血液 丝腺 和卵巢 用 0 05 DEPC 水清洗后 70 保存备用 RNA抽提用 Rneasy Mini Kit QIAGEN试剂盒 参照 试剂盒说明书进行 1 3 cDNA 第一链合成 取 0 2 滋 g 总 RNA 反转录 反转录和 PCR 反应 操作均按 GenHunter RNA spectra 试剂盒说明书进 行 反转录体系 2 滋 mol L H T 11 A G C 2 0滋 L 5 伊 RT Buffer 4 0 滋 L 250 滋 mol L dNTPs 1 6 滋 L 加 DEPC 水至 19 滋 L 进行如下反应 65 5 min 立即 冰上 2 min 加入 1U M MLV 反转录酶 37 60 min 75 5 min 1 4 荧光差异显示 以 3 种荧光锚定引物 3 anchored oligo T11A FH T11A C G primer 5 TTTTTTTTTTTA 3 5 TTTTTTTTTTTC 3 5 TTTTTTTTTTTG 3 和 10 种随机引物 arbitraryprimers HAP9 5 TCGGTCATAG 3 HAP10 5 GGTACATTGG 3 HAP11 5 TACCTAAGCG 3 HAP12 5 CTGCTTG ATG 3 HAP13 5 GTTTTCGCAG 3 HAP14 5 GA TCAAGTCC 3 HAP15 5 GATCCAGTAC 3 HAP 16 5 GATCACGTAC 3 HAP17 5 GATCTGACA C 3 HAP18 5 GATCTCAGAC 3 作不同组合 进行 FDD PCR 反应 其中荧光锚定引物与逆转录所用 H T 11 N锚定引物一致 所用荧光为绿色荧光 在 PCR 体系中依次加入 10伊 PCR 缓冲液 2 0 滋 L 250 滋 mol L dNTPs 1 6 滋 L 2 滋 mol L 荧光锚定引物 2 0 滋 L 2滋 mol L随机引物 2 滋 L 逆转录产物 2 滋 L DNA聚合酶 Quagen 1 U 加水至 20 滋 L 反应条件 为 92 30 s 40 2 min 72 2 min 40 个循环 72 7 min 1 5 差异条带的克隆鉴定 PCR 反应结束后 其产物在 5 变性聚丙烯酰 胺凝胶中电泳 4 h 1 500 V 电泳结束后 用荧光成 像扫描仪 FMBIO域 对凝胶进行 505 nm 波段荧光 扫描 依据扫描图像定位切取差异条带 置 50 滋 L水 中 100 水浴 20 min 取 2 滋 L 用于第 2 次 PCR 扩 增 扩增引物和扩增条件同 1 4 1 6 序列测定及数据库查询 用 低 熔 点胶 法 回 收的 差 异 片 段 克 隆 入 TaKaRa 公司 pMD18 T 载体中 转化大肠杆菌 DH5琢 提取质粒 测定序列 应用 Blast 程序将所得到的测序结果与 GenBank 数据库 和 Silkbase 数据库进行同源性和功能比较分析 1 7 PCR 再次扩增 A14 6 条带序列经过 GenBank 数据库 Blast 分 析 根据获得的完整开放阅读框 ORF 序列 在其内 部位点设计引物进行 RT PCR 再次扩增 引物扩增 长度 1 706 bp 片段鉴定 上游引物 1 5 CTTGGGGTCCTTCGTATTGG 3 下游引物 2 5 GTGGTTGTTCCTGTCGCCTC 3 Primer 1 和 primer 2 在 ORF 内的位点分别为 530 bp 处和 2 235 bp 处 PCR 体系 10伊 PCR 缓冲液 2 0 滋 L 250 滋 mol L dNTPs 2 0 滋 L 1 滋 mol L primers 1 0 滋 L 逆 转 录 产 物 1 滋 L DNA 聚 合 酶 TaKaRa 1 U 加水至 25滋 L 反应条件为 94 30 s 58 0 5 min 72 1 5 min 40 个循环 72 10 min 1 8 生物信息学分析 431 农 业 生 物 技 术 学 报 2008 年 分别利用美国国立生物技术信息中心 NCBI GenBank 数据库 家蚕基因组数据库 http silk SwissProt 蛋白质数据库 以 及采用相关生物学软件 蛋白质序列与结构分析使 用 MEGA3 1 ClustalX 1 83 GENEDOC 软 件 及 PROSITE http www expasy org prosite 等数据库 1 9 差异基因组织表达分析 添氟处理 48 h 时 以各组织的第一链 cDNA 为 模板 家蚕细胞质肌动蛋白 A3 A3 Gen Bank No X04507 基因作为参比基因 对添氟区和 对照区进行 RT PCR 分析 PCR 反应体系和程序同 上 1 7 循环数为 40 扩增结束后 PCR 产物用用 1 2 琼脂糖凝胶电泳检测 2 结果 2 1 荧光差异显示结果 以 3 种荧光锚定引物和 9 种随机引物作 27 个 组合 对 440DZ 440F 441DZ 和 441F 4 个材料中肠 组织进行 FDD PCR 其中 A14 6 条带在抗性品系 441 清水和添氟处理后表达较高 图 1 图 1 FDD差异表达结果 Fig 1 Result of the FDD analysis 1 440DZ 2 440F 3 441DZ 4 441F 1和 3样品是清水处理家蚕 48 h中肠cDNA 2和4样品是氟化钠处理家蚕48 h中肠 cDNA A14 6为差异表达片段 1 440DZ 2 440F 3 441DZ 4 441F 1 and 3 from midguts cDNA after water treatment for 48 h 2 and 4 from midguts cDNA after fluoride treatment for 48 h The differential expression band A14 6 is indicated by an arrow 2 2 差异片段的克隆鉴定及序列测定 A14 6 片段 2 次 PCR 扩增后克隆到 pMD18 T 载体并酶切鉴定 图 2 a 测序后经 blast 分析获得全 长 cDNA 序列 该序列编码 基因 GenBank No AB008449 进一步依据 ORF设计引物 primer 1 和 primer 2 扩增长度 1 706 bp 片段 与预测长度相 同 图 2 b 图2 A14 6的 pMD18 T克隆酶切鉴定 a 及 PCR鉴定 b Fig 2 Verification of A14 6 existence by using enzyme to digest vector pMD18 T a and identification of the by PCR b a M marker 1 芋和 玉双酶切 b M marker 1和2分别为 440DZ和 441DZ样品 a M maker 1 digestion by 芋 and H玉 b M maker 1 440DZ 2 441DZ 2 3 分析 基因包含 127 个核甘酸的 5 非翻译 区 2895 核甘酸的开放阅读框 ORF 和 626 核甘酸 的 3 非翻译区 并且还有 poly A 结构 SwissProt 蛋白质数据库 http www expasy org sprot 分析表 明 编码 965 个氨基酸 分子量为 108 800 kD 等电点为 6 370 基因组比对其分布于多个 contig 序 列 contig572416 contig047966 con tig002340 和 contig026655 将 contig序列拼接后使 用 http pbil univ lyon1 fr sim4 php 分析 该基因含 有 19 个外显子和 18 个内含子 剪切信号符合 GT AG 规则 家蚕 BCL 2 蛋白质氨基酸数量远多 于其它物种 BCL 2 蛋白 结构分析表明其 C 末端 没有疏水跨膜结构 2 4 BmBCL 2 蛋白同源性分析 采用 ClustalX1 83 MEGA3 1 和 Treeview 软件 对 4 个物种 BCL 2 BCL XL和 BCL W抗凋亡蛋白 氨基酸序列进行保守性分析 结果显示 BCL 2 家族 均具有 BH1 BH2 BH3 和 BH4 4 个功能域 并且 均按 BH4 BH3 BH1 和 BH2 顺序排列 BmBCL 2 与人 猕猴 和狗 的 BCL 2 HsBCL 2 MmBCL 2 和 Cf BCL 2 蛋白保守性相对较低 在其它物种如人 猕 猴和狗中 这 3 个物种的 BCL 2 与三者的 BCL XL 432 第 3 期 周红亮等 家蚕 基因的克隆 序列分析及其表达模式 和 BCL W 保守性较高 图 3 进化树分析表明 BmBCL 2 与其它 3 物种的 BCL 2 蛋白之间的亲缘 关系较远 与 BCL W家族蛋白亲缘关系最近 Bm BCL 2 与人 猕猴和狗 BCL 2 亲缘关系由远到近 同时与人 猕猴和狗的 BCL XL 和 BCL W蛋白也 符合由远到近的亲缘关系 BCL 2 家族蛋白亲缘关 系特征总体上符合生物的进化过程 图 4 图 3 BmBCL 2与其它BCL 2家族蛋白同源结构 多序列比对 Fig 3 Alignment of the homology sequence between BmBCL 2 and other BCL 2 proteins 黑底白字表示氨基酸相似序列 灰色和黑色表示相似氨基酸序列 虚 线表示未配对序列 BmBCL 家蚕B cell lymphoma lewkmia CfBCL 狗B cell lymphoma lewkmia MmBCL 猕猴B cell lymphoma lewkmia HsBCL 人B cell lymphoma lewkmia Identical residues are white on black and similar residues are dark gray and black the part of dashed lines represent unpaired residues BmBCL B cell lymphoma lewkmia CfBCL B cell lymphoma lewkmia MmBCL B cell lym phoma lewkmia HsBCL B cell lymphoma lewkmia 图 4 BmBCL 2与其它相关 BCL 2的系统发育树 Fig 4 Phylogenetic tree showing the relationship of BmBCL 2 and other related BCL 2 BmBCL CfBCL MmBCL and HsBCL seeFig 3 2 5 在耐氟品系和敏感品系组织表达分析 结果如图 5 所示 清水对照处理时 在 441DZ和 440DZ的 5 个组织中肠 血液 脂肪体 丝 腺和卵巢中均有表达 在抗性品系 441DZ组织中表 达丰度相对高于敏感 440DZ品系 并且在中肠和脂 肪体两个组织中表达水平较高 而在血液的表达量 相对较低 图 5 在抗性441DZ和感性 440DZ品系组织中的分布 Fig 5 Tissue distribution of in resistant strain 441DZ and susceptible 440DZ 1 中肠 2 脂肪体 3 血液 4 丝腺 5 卵巢 1 midgut 2 fat body 3 hemocyte 4 silkgland 5 ovary 图 6 结果显示 在对照组 441DZ 和 440DZ 中 表达水平较高 在添氟处理时 相对于对照 组 441DZ 和 440DZ 在氟化物刺激状态下 在 441F和 440F表达量稍有下调 同样 在 440F 中表达量的下调幅度大于在 441F中的下调幅 度 图 6 添氟后 在不同品系中肠中的表达 Fig 6 Expression levels of in the midguts of different strains treated by fluoride 1 440DZ 2 440F 3 441DZ 4 441F 3 讨论 本实验通过荧光差异显示技术获得 基 因 分析表明 BmBCL 2 具有 BH4 结构 已有研究 表明 BCL 2 家族蛋白保守结构域 BH4 可能与抑制 细胞凋亡功能有关 Vaux and Korsmeyer 1999 Reed 1998 而氟能诱导脂质过氧化作用 吕顺霖和丁春 433 农 业 生 物 技 术 学 报 2008 年 参 考 文 献 Budinger G R Tso M McClintock D S Dean D A Sznajder J I and Chandel N S Hyperoxia induced apoptosis does not requiremitochondrialreactiveoxygenspeciesandis regulated by BCL 2 proteins J 2002 277 18 15654 15660 Cai J Y and Jones D P Superoxide in apoptosis mitochandrial generation triggered by cytochrome closs J 1998 273 19 11401 11404 Chen J Chen X Yang K Xia T and Xie H Studies on DNA damage and apoptosis in rat brain induced by fluoride J 2002 36 4 222 224 In Chinese Guo Z Zhu Q Hu C and Yang Y Study on lipid peroxidation of electrolyzing aluminum workers J 2002 31 2 78 80 Ha J Chu Q Wang A Xia T and Yang K Effects on DNA damage and apoptosis and p53 protein expression induced by fluoride in human embryo hepatocytes J 2004 33 4 400 402 Hirano S and Ando M Fluoride mediates apoptosis in osteosar coma UMR 106 and its cytotoxicity depends on the PH J 1997 72 1 52 58 Hockenbery D M Oltvai Z N Yin X M Milliman C L and Ko rsmeyer S J functions in an antioxidant pathway to pre vent apoptosis J 1993 75 2 241 251 Hua K 华 坤 Zhao H 赵 红 Huang M 黄 民 and Li G S 李 广生 Effects of fluoride on ionized calcium and calcium channel in osteoblast like cell J 中国应用生理学杂志 2003 19 2 179 181 in Chinese with English abstract Jang J H and Surh Y J Potentiation of cellular antioxidant ca pacity by Implications for its antiapoptotic function J 2003 66 8 1371 1379 Jing L Shao Z J Pen L Q and Li G S Hepatocyte apoptosis in fluoride rats J 中华流行 病学杂志 1999 18 84 86 in Chinese Kowaltowski A J Fenton R G and Fiskum G Bcl 2 family pro teins regulate mitochondrial reactive oxygen production and protect against oxidative stress J 2004 37 1 1845 1853 阳 2002 和引起细胞异常凋亡 Jing 1999 Hirano and Ando 1997 因此 可能对氟诱 导脂质过氧化引起的细胞异常凋亡起抑制作用 从 而保护机体免受损伤 从本实验结果来看 在添水对照处理时 在家蚕抗性品系 441DZ 各组织的表达水 平相对高于敏感品系 440DZ 在添氟处理时 在抗性品系 441F 中肠的表达水平高于在 感性品系 440F 中肠表达水平 在氟短期处理下 相 对于清水处理品系 441DZ 和 440DZ Bmbcl 2 在 441F 和 440F 中肠表达量稍有下调 但在感性品系 440F 下调的幅度明显高于抗性品系 441F 说明 在抗性品系 441 表达水平高于感性品系 440 在抗性品系 441 的高表达暗示其可能 参与耐氟功能 已有实验表明 能降低过氧化 作用诱导的肺损伤并提高鼠的生存率 Ward 2000 能通过增加细胞内的抗氧化剂谷胱甘肽 GSH 的含量来抑制过氧化作用 Hockenbery 1993 Kowaltowski 2004 Jang and Surh 2003 并且对过氧化作用引起的细胞凋亡具有抗性功能 Budinger 2002 同时 Cai and Jones 1998 的 实验也表明 能抑制超氧阴离子的产生间接的 抵抗过氧化作用 因此 可能通过抑制氟诱 导脂质过氧化作用 进而对细胞的异常凋亡和损伤 起保护作用 另外 赵涯东等 2004 和邵红等 2005 研究也证明高氟短期作用会引起某些基因表达水平 的变化 暗示 基因参与耐氟功能还受氟的 浓度 作用时间等因素影响 另外 可能通过高表达抑制 Ca 2 的跨 膜运动 进而抵抗氟中毒诱导的脂质过氧化作用 华 坤等 2003 研究发现氟可以使成骨细胞钙通道开 放 导致细胞内 Ca 2 浓度升高 从而对组织细胞造 成损伤 而 Lam 1994 曾报道 可抑制钙泵 特异性抑制剂 Thapsigargen TG 诱导的 WEH17 2 等细胞凋亡 暗示 可能通过抑制氟刺激下 胞内 Ca 2 的跨膜运动来抵抗组织细胞的损伤 同 时 Reynolds and Eastman 1996 在中国仓鼠卵巢细 胞 5AHSmyc 中去除细胞内贮存 Ca 2 后发现过度表 达的 仍可抑制细胞凋亡 提示 对胞内 Ca 2 浓度的调节作用也可能是其抑制凋亡的机制之 一 因此 可能对氟诱导脂质过氧化作用及 引起的细胞异常凋亡具有保护作用 434 第 3 期 周红亮等 家蚕 基因的克隆 序列分析及其表达模式 Lam M Dubyak G Chen L Nunez G Miesfeld R L and Destel horst C W Evidence that BCL 2 represses apoptosis by regu lating endoplasmic reticulum associated Ca 2 fluxes J 1994 91 14 6569 6573 Lin C Q 林昌麒 Mi Y D 糜懿殿 Yao Q 姚 勤 Wu DX 吴 冬秀 and Wei Z J 魏兆军 Discover dominant major gene resistant to the fluoride in silkworm J 蚕业科学 1997 23 4 237 239 in Chinese with Eng lish abstract Lv S L 吕顺霖 and Ding C Y 丁春阳 Membrane lipid peroxi dation in fluoride poisoned silkworm larvae J 浙江大学学报 2002 27 1 111 212 in Chinese with English abstract Lv S L 吕顺霖 Min S J 闵思佳 and Ding C Y 丁春阳 Stud ies on the activity of GSH Px in the hemolymph of fluoride poisoning Silkworm Larvae J 蚕 业科学 2002 28 1 61 63 in Chinese with English ab stract Reed J C Bcl 2 family proteins J 1998 17 3225 3236 Reynolds J and Eastman A Intracellular calcium stores are not required for mediated protection from apoptosis J 1996 271 44 27739 27743 Rzeuski R Chlubek D and Machoy Z Interactions between flu oride and biological free radical reactions J 1998 31 1 43 45 Shanthakumari D Srinivasalu S and Subramanian S Effect of fluoride intoxication