苏教版选修1 第四章 第二节 分子生物技术 学案.doc

第二节分子生物学技术1dna聚合酶不能从头开始合成dna，只能从3端延伸dna链，因此，dna的合成方向总是从子链的5端向3端延伸。2pcr反应需要dna模板、两种引物、四种脱氧核苷酸、耐热的dna聚合酶等条件。3pcr利用了dna的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。4pcr每次循环都包括变性、退火(复性)和延伸三步。5pcr扩增dna片段可以使目的片段呈指数增长。6测定dna分子的试剂是二苯胺。dna在酸性条件和加热下，能与二苯胺试剂生成蓝色的物质。 pcr扩增的原理和过程1细胞内dna复制的条件原料4种脱氧核苷酸模板2条dna母链酶解旋酶和dna聚合酶引物使dna聚合酶能够从引物的3端开始连接脱氧核苷酸2pcr扩增技术(1)概念：在体外快速扩增特定基因或dna序列(目的dna片段)的实验技术，又称为体外基因扩增技术或dna扩增技术。(2)pcr技术的原理：条件：dna模板、taqdna聚合酶、脱氧核苷酸引物、四种脱氧核苷酸。pcr扩增的特点：快速、简便和灵敏。进行pcr的先决条件：待扩增的dna片段3端的脱氧核苷酸序列要为已知。引物序列确定的依据是：被扩增区域的3端边界dna序列。3pcr反应的过程1什么是引物？dna复制时为什么需要引物？提示：所谓引物是指两段与待扩增的dna序列互补的一小段dna或rna片段。在dna扩增时，dna聚合酶不能从头开始合成dna，只能从引物的3端延伸dna链，因此克隆dna时应加入两种引物。2pcr扩增dna过程中是否还需要解旋酶？提示：不需要。94 高温使双链dna解旋为单链dna。3利用pcr技术扩增1个dna分子n次，所得dna分子中，不含引物的脱氧核苷酸链所占的比例是多少？含引物的dna分子所占的比例是多少？提示：1/2n；100%。1细胞内dna复制与体外dna扩增(pcr技术)的比较项目细胞内dna复制pcr技术不同点解旋解旋酶，边解旋边复制94 高温解旋，双链完全分开酶解旋酶，dna聚合酶，dna连接酶taq聚合酶引物rnadna或rna温度体内温和条件高温子链合成一条链连续(先导链)；另一条链不连续，先合成片段，再由dna连接酶连接(滞后链)两条子链均连续合成相同点提供dna模板四种脱氧核苷酸作原料子链延伸的方向都是从5端到3端特别提醒(1)dna母链的3端对应着子链的5端，即dna的两条链是反向平行的。(2)解旋酶的作用是使dna两条链的氢键断开，而dna聚合酶与dna连接酶都是催化形成磷酸二酯键的。(3)dna聚合酶是将单个核苷酸加到已有的单链片段的3端上，需要模板，而dna连接酶连接的是两条dna片段的缺口，不需要模板。2pcr技术(1)pcr原理：dna热变性的原理。双链dna单链dna(2)pcr的反应过程：变性：94 高温下作为模板的双链dna解旋为单链dna，如图：退火：反应体系的温度降至4060 时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链dna结合，如图：延伸：当反应体系的温度回升到72 左右时，溶液中的四种脱氧核苷酸(a、g、c、t)在dna聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的dna双链，如图：特别提醒从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物延伸而成的dna单链会与引物结合，进行dna的延伸。这样，dna聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的dna序列，使这段固定长度的序列呈指数形式扩增。目的dna片段的体外扩增1dna片断的pcr扩增准备器材移入离心管煮沸、冰浴、低速离心。加入taq聚合酶放入pcr仪设置反应程序dna扩增。2dna分子的测定pcr技术的应用(1)医学上用该技术分析人的精液，对细菌、病毒感染进行早期诊断。(2)对单细胞中的dna进行扩增，用于遗传病的基因诊断，并在此基础上进一步制备无突变的dna片段供遗传病患者基因治疗时使用。(3)法医学用此技术来鉴别罪犯或进行亲子鉴定。(4)古生物学用此技术分析古生物化石样品，追溯其生存年代或迁徙踪迹。(5)在农业生物技术中，可运用此技术检测目的基因是否已经成功导入目标生物等。 pcr技术的原理例1多聚酶链式反应(pcr)是一种体外迅速扩增dna片段的技术。pcr过程一般经历下述三十多次循环：94 下变性(使模板dna解旋)4060 下退火(引物与dna模板链结合)72 下延伸(形成新的脱氧核苷酸链)。下列有关pcr过程的叙述不正确的是()a变性过程中破坏的是dna分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现b退火过程中引物与dna模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成的c延伸过程中需要dna聚合酶和四种核糖核苷酸dpcr与细胞内dna复制相比所需要酶的最适温度较高精讲精析变性是为了使dna内部的氢键断裂，双螺旋打开，体内复制时借助解旋酶来实现；借助碱基互补配对原则，引物可与dna模板链结合；延伸时是形成新的dna分子，需要以脱氧核苷酸为原料；pcr过程的温度高，会导致一般的dna聚合酶失活，需特定的耐高温dna聚合酶。答案c有关pcr技术的下列叙述，不正确的是()a聚合酶链式反应，是用dna聚合酶在体外扩增dna片段的技术b在用pcr技术扩增dna时，dna的复制过程与细胞内dna的复制类似cpcr反应需在一定的缓冲溶液中进行，只需提供dna模板以及四种脱氧核苷酸即可dpcr一般经历三十多次循环，每次循环均分为变性、退火和延伸三个阶段解析：选cpcr反应需要在一定的缓冲溶液中进行，需提供dna模板、分别与两条模板链相结合的两种引物、四种脱氧核苷酸、耐热的dna聚合酶，同时通过控制温度使dna复制在体外反复进行。结合dna的复制、基因工程等知识综合考查pcr技术例2(江苏高考)请回答基因工程方面的有关问题：(1)利用pcr技术扩增目的基因，其原理与细胞内dna复制类似(如下图所示)。图中引物为单链dna片段，它是子链合成延伸的基础。从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物a的dna片段所占的比例为_。在第_轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的dna片段。(2)设计引物是pcr技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。第1组：_；第2组：_。(3)pcr反应体系中含有热稳定dna聚合酶，下面的表达式不能正确反映dna聚合酶的功能，这是因为_。(4)用限制酶ecorv、mbo i 单独或联合切割同一种质粒，得到的dna片段长度如下图(1 kb即1 000个碱基对)，请画出质粒上ecorv、mbo i 的切割位点。精讲精析(1)从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物a的dna片段所占的比例为15/16。在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的dna片段。(2)某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理，原因：引物和引物局部发生碱基互补配对而失效；引物自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。(3)dna聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链dna片段的引物链上。(4)根据图示，该质粒为环形质粒。用限制酶ecorv单独切割该质粒时，只形成一个片段，说明该质粒上只有1个限制酶ecorv的识别位点。用限制酶mbo i 单独切割该质粒时，形成两个片段，说明该质粒上有两个限制酶mbo i的识别位点。用限制酶ecorv和mbo i联合切割该质粒时，形成三个片段，其中有一个片段的长度与用mbo i单独切割该质粒时产生的片段长度相同(2.5 kb)，另外的两个片段是5.5 kb和6 kb，这说明限制酶ecorv的切割位点存在于用mbo i单独切割该质粒时产生的另一片段(11.5 kb)上。答案(1)15/16三(2)引物和引物局部发生碱基互补配对而失效引物自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效(3)dna聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链dna片段的引物链上(4)见下图dna扩增的理论计算dna扩增与dna复制类似，呈指数形式扩增。若只有一条dna模板，则复制n次后有2n条dna；若一开始有a条模板，则复制n次后有a2n条dna。实际操作过程中，由于无关变量的影响，一般来说实验值要略小于理论值，若扩增效率为x，y代表dna片段总数，n代表循环次数，那么y(1x)n。 课堂回扣练习1关于dna复制，下列叙述正确的是()adna聚合酶不能从头开始合成dna，只能从5端延伸dna链bdna复制不需要引物c引物与dna母链通过碱基互补配对进行结合ddna的合成方向总是从子链的3端向5端延伸解析：选cdna复制是指利用母链dna为模板，从5端到3端进行复制合成与亲代dna完全相同的两个dna分子的过程。在复制过程中，需要引物、四种脱氧核苷酸、dna聚合酶等条件，引物与dna母链通过碱基互补配对进行结合，作为复制的起点。2标准的pcr过程一般分为变性、退火、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是()a94 ，56 ，72 b72 ，56 ，94 c56 ，94 ，72 d80 ，56 ，72 解析：选a当温度上升到94 时，双链dna解旋为单链，称之为变性；当温度下降到4060 时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链dna结合，称为退火；当温度上升到72 左右时，溶液中的四种脱氧核苷酸在taq聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的dna链，称为延伸。3pcr实验操作中，下列说法不正确的是()apcr反应中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌b在微量离心管中添加各种试剂时，只需一个枪头c用手轻弹离心管侧壁的目的是使反应液充分混合d离心的目的是使反应液集中在离心管底部，提高反应效率解析：选b为了防止外源dna等因素的污染，pcr反应中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌；在微量离心管中添加各种试剂时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换，以确保实验的准确性；离心的目的是使反应液集中在离心管底部，提高反应效率。4(江苏高考)小鼠杂交瘤细胞表达的单克隆抗体用于人体试验时易引起过敏反应，为了克服这个缺陷，可选择性扩增抗体的可变区基因(目的基因)后再重组表达。下列相关叙述正确的是(多选)()a设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列b用pcr方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列cpcr体系中一定要添加从受体细胞中提取的dna聚合酶d一定要根据目的基因编码产物的特性选择合适的受体细胞解析：选bd设计扩增目的基因的引物时，要考虑扩增的目的基因与载体两端序列碱基互补配对。dna复制沿着模板进行，不必知道基因的全部序列。pcr技术中的dna聚合酶是耐高温的dna聚合酶，不是从受体细胞中提取的dna聚合酶。目的基因编码产物不同，相应的受体细胞不同。5pcr(多聚酶链式反应)技术是一项在生物体外复制特定dna片段的核酸合成技术，下图表示合成过程，请据图分析回答：(1)a过程高温使dna变性解旋，对该过程原理的叙述，正确的是()a该过程用到耐高温的解旋酶破坏氢键b该过程用到限制酶破坏磷酸二酯键c该过程不需要解旋酶的作用d该过程与人体细胞的过程完全相同(2)c过程要用到的酶是_。这种酶在高温下仍保持活性，因此在pcr扩增时可以_加入。pcr反应除提供酶外，还需要满足的基本条件有：_。(3)如果把模板dna的两条链用15n标记，游离的脱氧核苷酸不做标记，控制“95 55 72 ”温度循环3次，则在形成的子代dna中含有15n标记的dna占_。(4)如果模板dna分子共有a个碱基对，其中含有胞嘧啶m个，则该dna复制10次，需要加入胸腺嘧啶脱氧核苷酸_个。(5)pcr中由碱基错配引起的变异属于_。解析：(1)高温所起的作用类似于解旋酶，使双链dna解聚为单链。(2)c过程为pcr技术的延伸阶段，当系统温度上升至72 左右时，溶液中的四种脱氧核苷酸在taqdna聚合酶的作用下合成新的dna链。taqdna聚合酶是耐热的，高温下不变性，所以一次性加入即可。pcr即为体外dna复制，所需条件与体内dna复制基本相同，都需要模板、原料、能量、酶。(3)pcr技术遵循半保留复制的特点。经过3次循环，共产生23个dna分子，其中有2个dna分子含有15n标记。(4)在一个双链dna分子中，(ct)占碱基总数的一半，故t的数目为am，复制10次，相当于新增加了(2101)个dna分子，故需补充t的数目为(2101)(am)。(5)基因中的碱基对改变属于基因突变。答案：(1)c(2)taqdna聚合酶一次dna模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，同时通过控制温度使dna复制在体外反复进行(3)25%(4)(2101)(am)(5)基因突变课下综合检测一、选择题1dna的复制需要引物，主要原因是()a可加快dna的复制速度b引物可与dna母链通过碱基互补配对结合c引物的5端有助于dna聚合酶的延伸dna链ddna聚合酶只能从3端延伸dna链解析：选ddna聚合酶不能从5端开始合成dna，而只能从3端延伸dna链，因此，dna复制需要引物。当引物与dna母链通过碱基互补配对结合后，dna聚合酶就能从引物的3端开始延伸dna链，dna的合成方向总是从子链的5端向3端延伸。2下列有关pcr技术的叙述，不正确的是()apcr技术利用的是碱基互补配对原则bpcr技术可用于基因诊断，判断亲缘关系等cpcr技术需在体内进行dpcr技术可能为变性、退火、延伸三个阶段解析：选cpcr技术是聚合酶链式反应的简称，是在体外快速大量复制dna片段的一种新技术。3下列属于pcr技术的条件的是()单链的脱氧核苷酸序列引物目的基因所在的dna片段脱氧核苷酸核糖核苷酸dna连接酶耐热的dna聚合酶dna限制性核酸内切酶abc d解析：选bpcr技术的条件：模板，本题为第项；引物，本题为第项；原料，本题为第项；酶，本题为第项。4下图是pcr反应过程中哪次循环的产物()a第一次循环 b第二次循环c第三次循环 d第四次循环解析：选a在pcr反应中，以引物为标记，第一次循环时加入的dna为模板，两条dna链可分别由引物和引物与其结合并在dna聚合酶的作用下延伸，所以形成的每个子dna中只有一种引物；从第二次循环开始，上次产生的含引物的dna分子单链又可作为模板，形成的dna分子两端均含引物。5.右图表示dna变性和复性示意图，相关说法正确的是()a向右的过程为加热(5060 )变性的过程b向左的过程是dna双链迅速致冷复性c变性与在生物体内解旋过程的实质相同d图中dna片段共有8个游离的磷酸基、8个3端解析：选cdna体外的变性同体内的解旋实质是相同的，都是使氢键断裂，dna双螺旋打开，只是体内需解旋酶，体外是高温条件。6下列有关pcr技术中引物的叙述，正确的是()a引物是一小段dna分子或双链rna分子b扩增一个dna分子至少需要的引物数目等于新合成的dna子链数目c两种引物之间能够发生碱基互补配对ddna聚合酶只能从引物的5端连接脱氧核苷酸解析：选b引物是一小段单链dna分子或单链rna分子；在dna分子扩增时，需要两种引物，由于新合成的子链都需要引物作为复制的起点，则扩增一个dna分子至少需要的引物数目等于新合成的dna子链数目；两种引物分别与dna母链之间发生碱基互补配对，并不是两种引物之间发生碱基互补配对；dna聚合酶只能从引物的3端连接脱氧核苷酸，从而使子链dna分子的复制方向只能是5端3端。7pcr过程与细胞内的dna复制过程相比，主要有两点不同，它们是()pcr过程需要的引物是人工合成的单链dna或rnapcr过程不需要dna聚合酶pcr过程中dna的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的pcr过程中，dna不需要解旋，直接以双链dna为模板进行复制abc d解析：选cpcr过程与细胞内的dna复制过程相比，主要有两点不同：一是pcr过程需要的引物是人工合成的单链dna或rna，长度通常为2030个核苷酸。二是在pcr过程中，dna解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的。8关于dna分子测定的以下叙述，不正确的是()a所用的试剂是二苯胺，该试剂分为a液和b液b在测定时应将0.1 mlb液加入10 mla液中混匀后使用c在常温条件下进行测定，注意观察颜色的变化d根据蓝色的深浅，能粗略地比较出扩增前后溶液中dna含量变化解析：选c测定dna分子应在沸水浴加热条件下进行，不能在常温条件下进行。二、非选择题9资料显示，近十年来，pcr技术成为分子生物实验的一种常规手段，其原理是利用dna半保留复制的特性，在试管中进行dna的人工复制如下图，在很短的时间内，将dna扩增几百万倍甚至几十亿倍，使分子生物实验所需的遗传物质不再受限于活的生物体。请据图回答：(1)加热至94 的目的是使dna样品的_键断裂，这一过程在生物体细胞内是通过_酶的作用来完成的。通过分析得出新合成的dna分子中，at，cg，这个事实说明dna分子的合成遵循_。(2)新合成的dna分子与模板dna分子完全相同的原因是_和_。(3)通过pcr技术使dna分子大量复制时，若将一个用15n标记的模板dna分子(第一代)放入试管中，以14n标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制到第五代时，含15n标记的dna分子单链数占全部dna总单链数的比例为_。(4)pcr技术不仅为遗传病的诊断带来了便利，而且改进了检测细菌和病毒的方法。若要检测一个人是否感染了艾滋病病毒，你认为可以用pcr扩增血液中的_。a白细胞dna b病毒蛋白质c血浆抗体 d病毒核酸解析：通过pcr技术使dna分子大量复制时，同样遵循碱基互补配对原则，其复制方式仍然是半保留复制；复制到第5代即复制了4次；检测一个人是否感染了艾滋病病毒，可以通过检测该人的血液中是否含有病毒核酸来判定。答案：(1)氢解旋碱基互补配对原则(2)dna分子有独特的双螺旋结构复制过程中严格遵循碱基互补配对原则(3)1/16(4)d10在遗传病及刑事侦破案件中常需要对样品dna进行分析，pc