实验三、小鼠骨髓染色体制备与观察.ppt

实验三 小鼠骨髓染色体标本的制备及观察 李孝敬基础医学楼A412生科院办公室电话一 实验目的 初步掌握 小鼠 骨髓细胞染色体标本的制备原理和方法巩固显微镜的操作技术了解小鼠的染色体形态特征 二 实验原理 染色体是组成细胞核的基本物质 是基因的载体 染色体异常也称染色体发育不全 目前已确认染色体病综合征100余种 智力低下和生长发育迟滞是染色体病的共同特征 21三体综合征 18三体综合征 猫叫综合征 18三体综合征 二 实验原理 染色体标本的观察广泛应用于一些疾病的临床诊断中 例如白血病 恶性血液病等的诊断 染色体是染色质在细胞分裂期的存在形式 细胞分裂的中期 染色体在赤道板上排列清晰 是染色体观察的最佳时期 骨髓细胞数量多且分裂旺盛 可直接进行染色体标本的制备 取材方便 操作简单和无需无菌培养 是研究小型哺乳动物等染色体的常用方法 人骨髓染色体抽取 怎样才能制备一个好的染色体标本 获得大量处于有丝分裂中期的细胞 使细胞膜破裂 且染色体能够完整并较分散的释放出来 秋水仙素处理 秋水仙素溶液可抑制纺锤体的形成 使正在分裂的骨髓细胞停止在细胞分裂中期 积累大量中期分裂相细胞 低渗作用 使细胞充分膨胀 减少染色体间的相互缠绕和重叠 预固定 终止低渗作用 使细胞离心时不易破裂 固定维持细胞形态结构 高距离滴片 使细胞膜易于破裂 获得中期染色体标本 在显微镜下观察染色体的结构和数量 三 实验器材和试剂 1 器材蜡盘 手术剪 小镊子 平皿 注射器 10ml离心管 吸管 量筒 预冷载玻片 试管架 离心机 恒温水浴锅 显微镜 乙醚酒精 擦镜纸2 试剂100ug秋水仙素液 0 075mol LKCl低渗液 Giemsa染液 1 秋水仙素处理 选择体重20g左右的小白鼠 按2 4ug g 小鼠 秋水仙素 与处死前4h 对其进行腹腔注射100ug mL秋水仙素液 四 实验步骤 注意 剪去少量骨质 避免骨髓细胞丢失 擦净血迹和肌肉细胞以免影响观察 用0 075mol LKCl收集足量细胞 反复冲洗直到股骨发白 2 取材 颈椎脱臼法处死取两后肢股骨纱布擦净肌肉剪去股骨两头 暴露骨髓腔低渗液 5ml 冲洗至离心管内收集骨髓细胞 颈椎脱臼法处死小鼠 3 低渗 用吸管吹打骨髓细胞使其分散 加入预温37 的低渗液至8ml 将离心管至37 水浴锅中 保温至少30min后取出 使细胞充分吸水膨胀 低渗不足 则细胞膨胀不够 滴片时细胞不破裂 低渗过度 则细胞提前破裂 染色体观察不全 空气吹打法 用吸管橡胶头内的空气混匀液体 4 预固定 加1ml新配制固定液混匀1500r min 5min弃上清液 固定液 甲醇 冰乙酸 3 1 需现配 离心需要配平 作用 终止低渗 维持细胞的膨胀状态 防止离心破裂 5 固定 制细胞悬液 加固定液5ml吹打混匀固定15min离心1500r min 5min弃上清 加固定液0 2 0 4ml吹打成细胞悬液 准备制片使用 制备细胞悬液时 根据具体情况加固定液 以悬液呈现乳白色为宜 6 滴片 冰片倾斜30 细胞悬液距离玻片30cm高 在不重叠位置滴1 2滴 用口吹散细胞 过火焰干燥 注意 载玻片预冷 高度 吹散 不可使载玻片烫手 7 染色 在玻片上滴几滴Giemsa染液并铺匀 8 10min 倒去染液 晾干 染色盘中进行 8 小鼠染色体观察 低倍镜 高倍镜下寻找染色体分散的中期分裂相 小鼠骨髓染色体10 10 小鼠骨髓染色体10 40 数目观察 小鼠2倍体细胞染色体 数目2n 40条 其中19对为常染色体 一对为性染色体 染色体的核型分为4组 雄性XY 雌性XX Y染色体最小 形态特征观察 端着丝粒染色体 U V 五 注意事项 1 掌握好秋水仙素的浓度和处理时间 2 离心前需要配平 3 小鼠骨髓要冲洗干净 以收集足够的骨髓细胞 3 低渗处理是实验成败的关键 注意低渗时间 4 固定液要现配现用 固定要充分 5 载玻片要洁净并预冷 滴片要有一定的高度 6 细胞悬液不能太稀 要呈乳白色 7 烤片