rDNA鉴定微生物原理.ppt

微生物鉴定原理 汇报人 王伟 STEP01 STEP02 STEP03 STEP04 微生物鉴定原理 微生物定义 分类 16srDNA鉴定细菌原理 ITS鉴定真菌原理 目录 CONTENTS 01 微生物鉴定原理 微生物鉴定原理 通过DNA测序对微生物进行物种鉴定 菌种鉴定 是比传统生化鉴定更先进的鉴定方法 DNA测序不依赖菌种本身特点 对所有菌种均可使用 比传统生化鉴定更加快速 准确 02 微生物定义 分类 微生物是个体难以用肉眼观察的一切微小生物的统称 微生物定义 分类 微生物包括 细菌 病毒 真菌以及一些小型的原生生物 显微藻类等在内的一大类生物群体 它个体微小 与人类关系密切 微生物划分为以下8大类 细菌 病毒 真菌 放线菌 立克次体 支原体 衣原体 螺旋体 有些微生物是肉眼可以看见的 像属于真菌的蘑菇 灵芝等 还有微生物是一类由核酸和蛋白质等少数几种成分组成的 非细胞生物 但是它的生存必须依赖于活细胞 03 16srDNA鉴定细菌原理 100 33 100 66 100 100 16srDNA简介 鉴定原理 鉴定步骤 16srDNA鉴定细菌原理 01 02 定义 16srDNA 16SrRNA为核糖体的RNA的一个亚基16SrDNA就是编码该亚基的基因 鉴定是指用利用细菌16srDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定 16srDNA是细菌染色体上编码16srRNA相对应的DNA序列 存在于所有细菌染色体基因中 16SrRNA与16SrDNA的区别 16S中的 S 是一个沉降系数 亦即反映生物大分子在离心场中向下沉降速度的一个指标 值越高 说明分子越大 rDNA和rRNA中的小写字母 r 是ribosome 核糖体 的缩写 rDNA指的是基因组中编码核糖体RNA rRNA 分子的对应的DNA序列 也就是编码16SrRNA的基因 rRNA指的是rDNA的转录产物 它是构成核糖体的重要成分 核糖体由许多小的rRNA分子组装而成 16SrRNA是其中一个组件 一般所分析的对象都是16srDNA 因为DNA提取容易 也比较稳定 16srDNA简介 原因 什么原因使得各学者和分类学家使用16srDNA鉴定细菌 16srDNA保守性定义是什么 有什么作用 高变区 什么叫高变区 怎么样通过高变区鉴定种属关系 种间关系 鉴定原理 鉴定原理 保守性 鉴定原理 原因 16srDNA由于其种类少 含量大 约占细菌RNA含量的80 分子大小适中 存在于所有的生物中 在结构与功能上具有高度的保守性 同时还含有中度保守和高度变化的序列区域 具有高变性 可变区序列因细菌不同而异 恒定区序列基本保守 所以可利用恒定区序列设计引物 将16SrDNA片段扩增出来 利用可变区序列的差异来对不同菌属 菌种的细菌进行分类鉴定 鉴定原理 保守性 定义 基因的保守型指的是某一段序列在进化演变的过程中 在不同的物种都都一直保留 作用 科学家认为这些跨物种的相似性证明了某个特殊的基因完成了一些许多生命形式所必须的基本功能 因此在进化过程中保留了这些序列 保守序列区域反映了生物物种间的亲缘关系 16SrDNA分子的序列特征为不同分类级别的近缘种系统分类奠定了分子生物学基础 鉴定原理 高变区 细菌16S核糖体RNA rRNA 基因含有9个 高变区 V1 V9 其在不同细菌中表现出相当大的序列多样性 没有一个区域可以区分所有细菌 因此 需要进行系统研究 比较每个区域对特定诊断目标的相对优势 各区域序列差异性 鉴定原理 V1 V2 V3 V6 V4 5 7 8 核苷酸69 99 V1区域可用于区分常见的致病性链球菌sp 并区分金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌 CONS 物种 这个短序列是设计金黄色葡萄球菌特异性探针的理想选择 核苷酸137 242 V2区域可以将细菌物种区分为属种水平 该区域还能够区分常见的葡萄球菌和链球菌病原体以及梭菌 嗜血杆菌和奈瑟氏球菌 V2似乎也是区分分枝杆菌属的最佳靶标 V2具有100bp的平均长度 这是DNA探针的相对大的靶区域 核苷酸433 497 V3在区分细菌和属的水平方面与V2类似 V3比V2短 65个核苷酸对106个核苷酸 并且用对侧翼序列特异的通用引物的V3的PCR扩增将导致与V2相比更小的扩增子 在一些实时PCR测定中 较小的扩增子大小可能是优选的 核苷酸986 1043 尽管V6区域长度仅为58bp 但它显示出相当大的序列可变性 并能够区分大多数细菌物种 V6是用于区分炭疽芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌的测定的最佳靶区域 核苷酸576 682 822 879 1117 1173和1243 1294 这四个高变区 特别是V5 由于与其他高变区相比具有更高程度的序列保守性 因此不太适合物种鉴定 这可能导致灵敏度较低的测定 因为针对该区域设计的特异性探针可能不会与所有扩增的靶标结合 01 02 03 包括细菌基因组DNA提取 16srDNA特异引物PCR扩增 扩增产物纯化 DNA测序 序列比对等步骤 步骤 采用细菌16SrDNA通用引物对供试菌株进行PCR扩增 聚合酶链式反应 由高温变性 低温退火 复性 及适温延伸等反应组成一个周期 循环进行 使目的DNA得以迅速扩增 具有特异性强 灵敏度高 操作简便 省时等特点 PCR扩增 鉴定步骤 04 ITS鉴定真菌原理 ITS鉴定真菌原理 原理 内转录间隔区ITS由于不需要加入成熟核糖体 因此在进化过程中能够承受更多的变异 属于中度保守的区域 其保守性基本上表现为种内相对一致 种间差异比较明显 这种特点使ITS适合于真菌物种的分子鉴定以及属内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析 利用它