文献翻译_电子显微和微量热法对已知产地蜂胶抑菌机理的.pdf

电子显微和微量热法对已知产地蜂胶电子显微和微量热法对已知产地蜂胶 抑菌机理的研究抑菌机理的研究 摘要摘要 微热量和电子显微对蜂胶抗菌作用模式的研究方法已应用于无乳链球菌 有研 究表明 蜂胶通过阻止细胞分裂来抑止细菌的生长 从而导致了的假多细胞的形 成 此外 蜂胶还破坏了细胞质 细胞膜 细胞壁 引起局部溶解 并且还抑止蛋 白的合成 很明显 蜂胶对细菌的抑止作用的机理是很复杂的 不能和典型的抗生 素的抑菌作用形成类比 关键词关键词 蜂胶 抑菌作用 溶菌作用 电子显微镜研究 微量量热法 抑止蛋白合成 前言前言 蜂胶 一种由蜜蜂产生的天然树脂物质 广泛使用于耳鼻喉科 妇科 口腔 科 皮肤科的各种感染病的治疗中 蜂胶包含许多药学属性 例如抗细菌 抗真 菌 抗原生动物 抗病毒 抗炎症 免疫刺激活动 蜂胶抗菌 抗炎症的特性归因于黄酮类物质如松属素 高良姜素 对香豆酸苄 酯 咖啡酸酯衍生物 1 4 而局部麻醉活动归因于松属素 球松素和咖啡酸酯混 合物 5 蜂胶通过提高脾脏中噬菌斑形成细胞的数量 6 来对细胞免疫造成刺激效 果 而哺乳动物组织再生归因于游离氨基酸的存在 例如精氨酸 它可以刺激有丝 分裂和提高蛋白的生物合成 而脯氨酸促进胶原弹性蛋白的组建 7 此外由蜂胶 引起过敏性的变形性皮炎归因于肉桂酸酯 8 和咖啡酸酯 9 在先前的研究中 Simuth 等人 10 在蜂胶抑制大肠杆菌和金色链霉菌的 DNA 依赖 RNA 聚合酶类的过程中 证实了几个紫外吸收成分 因此 从这些已知成分来 讲 蜂胶对微生物的作用机理似乎变得更复杂 这个事实引导我们用电子显微和微 量热法的方法来研究蜂胶的抑菌模式 材料及方法材料及方法 蜂胶的提取 蜂胶于 1991 年采集于美因堡 上巴伐利亚 70 松柏类 欧洲冷杉 欧洲落叶 松 挪威云杉 30 混合林地 欧洲桤木 欧洲白桦 欧洲榛 欧洲山毛榉 黑 杨 英国栎 银白杨 并且收据可用 我们制出原蜂胶的乙醇溶液 25 v v 乙 醇 蜂胶的乙醇提取物 EEP 包含 0 82 咖啡酸 1 24 对香豆酸 0 62 阿魏 酸 0 4 异阿魏酸 0 84 苯甲酸 3 4 二甲氧基肉桂酸 以及黄酮类物质和糖 类 黄酮的总含量为 1 8 白杨素 非瑟酮 高良姜素 木犀草苷 槲皮素都定 性存在 细菌生长及实验环境 无乳链球菌 英国国家典型菌种保藏中心菌株 8181 NCTC b 型 来自于 中心公共实验室 伦敦 菌株 58 59 a 型 由 J Rotta 博士 卫生和流行病 学研究所 布拉格 友情提供 以上两种菌接于胰酶解酪蛋白酵母浸膏肉汤麦芽糖 补足培养基中 于 37 120rpm 震荡培养 细菌的生长程度用 PMQ3 蔡司分度计于 660nm 每小时测量一次 如果必要 样品可用培养基稀释 取对数期的菌在浓度为 A660 0 5 制成 10ml 每份 并加入蜂胶的乙醇提取物进 行培养 这是乙醇提取物处理的起始点 将蜂胶的乙醇提取物加入到菌悬液中使得 终浓度为 0 25 0 5 和 1 25 g ml 于 37 震荡培养两小时 一组菌悬液加入 100 l25 乙醇作为对照控制 在培养末期 每组培养液中取 5 l 菌悬液涂于无蜂 胶的琼脂培养基中 于 37 5 二氧化碳环境中培养 48h 以此检验不同浓度蜂胶 提取物作用下菌的再生能力 十二烷基磺酸钠 丙烯酰胺凝胶电泳 根据 Laemmli 方法使用凝胶电泳分析细胞内的蛋白质 以及不同蜂胶浓度作 用下的由无乳链球菌分泌的蛋白质 12 微热量法 根据之前的报道 11 使用微热量法调查蜂胶对无乳链球菌的生长及新陈代 谢的影响 电子显微镜检测 将对数期的菌液中加入蜂胶提取物使得终浓度为 2 5 g ml 培养 4h 之后将菌 悬液于 12000g 4 离心 10min Sorvall SS34离心机 并用 0 1mol ml pH 7 2 甲 次砷酸盐缓冲溶液进行冲洗 链球菌用 2 5 戊二醇 Serva Heidelberg FRG 进行 固定以备镜检 随后用 1 5 四氧化锇加上 1 65 重铬酸钾在甲次砷酸盐缓冲溶液 于室温中固定一小时 13 之后用 1 乙酸铀酰染色 在用乙醇梯度脱水之后 将细菌样品嵌入伦敦白胶中 此切片由 Reichert 3 超微切片机制成 之后用柠檬酸 铅染色 Reynolds 1963 用飞利浦 EM400 电子显微镜与 80kV 进行检测 结果结果 蜂胶提取物作用之后链球菌细胞的存活率 将对数生长期的无乳链球菌菌株 8181 b型 和菌株 58 59 a 型 置于蜂 胶提取物终浓度分别为 0 25 0 5 1 25 g ml 的培养基中培养 结果表明 在蜂胶 提取物浓度为 0 5 g ml 的组别中菌悬液的光学浓度 OD 有显著的减少 图 1表 明了被不同浓度蜂胶提取物作用后的链球菌细胞在血液琼脂培养皿中的再生能力 和未添加蜂胶提取物的对照组相比 被蜂胶提取物处理过的细胞在血液琼脂培养皿 中的再生能力下降了 并且菌株 58 59在 1 25 g ml 的蜂胶提取物浓度作用下 再 生能力完全被抑制 这些现象皆根据被蜂胶提取物作用后的细胞 OD值而得 此 外 菌株 58 59对蜂胶的敏感度比菌株 8181更高 在不同浓度的蜂胶提取物作用 2h之后 利用 SDS PAGE 电泳测量细胞外蛋白 的含量 发现相较于对照组 细胞外蛋白明显的减少 见图 2 分泌蛋白减少的 程度与作用于细菌的蜂胶提取物的浓度有关 通过分析胞内蛋白 发现被蜂胶提取 物作用后的细胞也用相似的结果 图图 1 将在含有蜂胶醇提物的胰酶解酪蛋白酵母浸膏肉汤培养基中生长两小时之后的无乳链球菌 菌株 8181 A 和菌株 58 59 B 分别吸取 5 g 涂于血液琼脂平板中 1 空白组 2 经 0 25 g ml 蜂胶提取物作用的链球菌 3 经 0 50 g ml 蜂胶提取物作用的链球菌 4 经 1 25 g ml 蜂胶提取物作用的链球菌 血液凝胶平皿在 37 5 二氧化碳的环境下培养 48h 图图 2 2 SDS PAGE 凝胶电泳分析在 TSB 培养基中培养 并被蜂胶提取物作用两小时的无乳链球菌 菌株 8181 A 和菌株 58 59 B 所产生的胞外蛋白 每组蛋白吸取 500 l 与两倍体积的 95 乙醇混合 于 20 电泳 30min 1 标准蛋白 2 添加蜂胶之前的菌组 3 未加蜂胶的对照 菌组 4 用 0 25 g ml 蜂胶提取物处理的菌组 5 用 0 50 g ml 蜂胶提取物处理的菌 组 6 用 1 25 g ml 蜂胶提取物处理的菌组 蛋白条带用 0 3 亮蓝 R 250 染色 微热量法测量蜂胶提取物的抑菌活性 图 3 图 4表示了无乳链球菌菌株 8181和菌株 58 59生长过程中的热量变化和 OD值变化 A 为对照组 不加蜂胶提取物 B 实验组 添加蜂胶提取物 相比于对照组 蜂胶提取物的添加 0 25或 0 50 g ml 直接抑制了产热和菌体的 生长 生长和热谱曲线回到了最低水平 并且在此阶段稳定了长达 15小时知道回 到正常水平前 实验表明菌株 8181对蜂胶的敏感程度比菌株菌株 58 59要低 蜂 胶提取物对于无乳链球菌的最小抑制率 MIC 在 0 5 g ml 到 1 5 g ml 之间 此外 电子显微镜对蜂胶提取物作用后的细胞的观察到了由于细胞分裂被抑制 而因为的假多细胞链球菌的形成 图 5 蜂胶提取物也引起了细胞质出现空腔的 紊乱 图 5A 以及细胞质的纤维化结构 图 6B 图图 3 3 图 图 4 4 微热量法测量在含有麦芽糖的 TSB 培养基中培养 并被蜂胶提取物作用的无乳链球 菌菌株 8181 A 和菌株 58 59 B A 对照组 B 蜂胶提取物作用组 P 热谱曲线 产 热量 A578 细菌生长曲线 在 578mn 测 OD 值 箭头表示蜂胶提取物加入到链球菌中的时 间 电子显微镜观察被蜂胶提取物作用之后的链球菌细胞 目前为止 还未知有电子显微镜用于蜂胶抑菌活性的研究 图 5 图 6展示了 无乳链球菌 菌株 8181 在经过蜂胶提取物 2 5 g ml 于 37 两小时的处理之后 的菌形态 未用蜂胶提取物处理的链球菌细胞如图 5A所示 完整的细胞质 细胞 膜和细胞壁清晰可见 图 5B D 和图 6A 图 6B 展示了链球菌在蜂胶作用下产生的 结构变化 以此看来 蜂胶抑制细胞的分裂 引起子细胞无法与母细胞分离 图 5B 图 5C 此外 细胞膜的变化 就像细胞壁结构的破坏一样可以被观察到 图 5C 图 5D 图 6B 图图 5 电镜观察培养于 TSB 培养基中 37 并被蜂胶提取物 2 5 g ml 作用两小时的无乳链 球菌菌株 8181 A 对照组 链球菌细胞在分裂过程中 箭头处所示为横壁的产生 B C D 被蜂胶提取物处理过的薄截面 B 细胞分裂被蜂胶所抑制 子细胞的横壁 箭头处 未 分开 C 分裂后的子细胞未分离 1 2 3 4 细胞壁结构 箭头处 出现缺陷 细胞质 内物质紊乱 D 不同分裂位面 箭头处 的出现证明了细胞分裂的紊乱 由于蜂胶提取物的 抑制细胞壁的分离而引起假多细胞的形成 图图 6 被蜂胶提取物 2 5 g ml 作用 2h 后的无乳链球菌菌株 8181 切片 A 细胞质开始紊乱 箭头处 B 细胞内容物完全泄出 细胞质中有纤维状结构产生 箭头处 细胞壁上有缺 口产生 双箭头处 讨论讨论 用蜂胶提取物作用于无乳链球菌细胞的实验可得出蜂胶提取物可抑制微生物的 再生 图 1 从而证实蜂胶的天然抑菌特性 用微热量法观察到链球菌生长过程 中特征热谱曲线的变化证明了蜂胶提取物减少或抑制了细胞新陈代谢的活动强度 蜂胶对于链球菌的最小抑菌浓度在 0 5到 1 5 g ml 之间 电子显微镜观察被蜂胶提取物作用下的无乳链球菌的行为似乎有些复杂 细胞 分裂以及细胞壁的分开被抑制导致了假多细胞的形成 这种效应可能是由于所谓的 横壁分割系统的堵塞所导致的 就像金黄色葡萄球菌被甲氧苄氨嘧啶所影响一样 14 蜂胶提取物抑制细胞分裂表明这种天然的药物能像抑制 DNA复制的萘啶 酸一样 间接地抑制细胞分裂 蜂胶提取物引起的对细胞壁的影响可以解释蜂胶和苄青霉素作用于金黄色葡萄 球菌的蜂胶抗性菌株时所产生的协同作用 有人推断蜂胶蜂胶的抗真菌的活力 16 17 就像与固醇类物质 麦角固醇 形成紧密复合物两性霉素 B 蜂胶提 取物对细菌的作用导致