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土壤中枯草芽孢杆菌的分离和筛选2013023123刘倩倩一、实验目的 1.掌握枯草芽孢杆菌的分离筛选的基本原理,熟练掌握无菌接种技术、微生物分离筛选技术和微生物形态观察技术。2.了解枯草芽孢杆菌的分布、营养、生长等特点,以及它所具有的产淀粉酶的功能。根据这些特点进行分离和筛选,从而得到纯菌株。 二、 实验原理 枯草芽孢杆菌属革兰氏阳性菌,芽孢0.60.91.01.5微米,椭圆到柱状,位于菌体中央或稍偏,芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明,污白色或微黄色,在液体培养基中生长时,常形成皱醭。需氧菌。有的菌株是-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌;有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系。广泛分布在土壤及腐败的有机物中。选择含淀粉丰富的土壤为最佳,80度的水浴处理样品1小时,目的是杀死微生物营养体,残留芽胞。利用稀释涂布法,在淀粉的培养基培养,培养1-3天后,观察。然后,进行初筛与纯化,利用显微镜进行革兰氏染色,确认是否为枯草芽孢杆菌。再复筛,测定其淀粉酶活,最后确定菌株。三、实验材料 (1)选择培养基 本次实验进行产淀粉酶的枯草芽孢杆菌的筛选,所以应选淀粉培养基。 配方: 牛肉膏 5.0g 蛋白胨 10.0g 氯化钠 5.0g 可溶性淀粉 10.0g 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml 调整pH至7.2 配置时应先把淀粉用少量蒸馏水调成糊状,再加入到融化好的培养基中。 (2)溶液或试剂 牛肉膏 1.25g 蛋白胨 2.5g 氯化钠 1.25g 可溶性淀粉 2.5g 琼脂 5g 碘11克,碘原液2毫升,碘化钾42克,可溶性淀粉2克,磷酸氢二钠45.23克,柠檬酸8.068克,氯化钴25克,重铬酸钾3.34克, 100毫升0.01NHCL。 (3)仪器或其他用品 平板培养皿 10个、试管15支、三角瓶2个、烧杯3个、称量纸、高压蒸汽灭菌锅、干燥箱、恒温培养箱、超净工作台、无菌涂布器、电热恒温水浴、500ml量筒、显微镜、无菌吸管、无菌培养皿、无菌刻度吸管、酒精灯、记号笔、火柴、试管架、接种钩、滴管等。 四、实验步骤 倒平板制备梯度稀释液涂布培养初筛复筛纯化保存(1)实验前准备 制备淀粉培养基,无菌水,在121摄氏度下灭菌20min。倒平板。把接种工具,培养基,和其他用品全部在超净工作台上摆好,进行紫外线灭菌30min。(2)制备土壤稀释液 取土样时最好选取如花坛等地方的土样,选好采样地点,产去表层5cm,去5-15cm处。用无菌器具规范采样几十克,装入无菌的塑料袋或纸袋中扎好,记录采样时间、地点、采样环境等以备考证。采样后应尽快分离。振摇约二十分钟,使土样与水充分混合,将细胞分散。放入盛有99ml无菌水三角瓶中,常压80度的水浴处理样品1小时后,取出。 用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀,然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml加入另一盛有9ml无菌水的试管中,混合均匀,以此类推,制成10-2 、10-3、10-4、10-5不同稀释度的土壤溶液。 (3)涂布 将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10-3、10-4、10-5三种稀释度,然后用无菌吸管分别由10-3、10-4、10-5三管土壤稀释液中各吸取0.2ml,小心地滴在对应平板培养基表面中央位置。 用无菌涂布器涂布。右手拿无菌涂布器平放在平板培养基表面上,将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展,使之分布均匀。室温下静置5-10min,使菌液浸入培养基。 (4)培养 将淀粉培养基平板倒置于30C培养箱中培养13d。 (5)初筛 观察菌落表面粗糙不透明,呈污白色或微黄色,将这样的菌种单个菌落分别挑取少许细胞接种到培养基上,置于30C的培养箱中培养,若发现有杂菌,需要再一次进行分离纯化。(如不能用肉眼更好的观察,可对其进行革兰氏染色,在显微镜下观察,与标准菌种比较。) (6)复筛 测定其淀粉酶活。 1)试剂和器材 1.试剂 : 碘原液:称取碘11克,碘化钾22克,加水溶解,稀释至500毫升。 稀碘液:取碘原液2毫升,加碘化钾20克,稀释至500毫升,此试剂随配随用。 2%淀粉液:称取干燥过的可溶性淀粉2克,加5毫升蒸馏水,搅拌混和,再徐徐倾入70毫升煮沸的蒸馏水中。继续煮沸2分钟,冷却至室温,加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(PH为6)。 柠檬酸缓冲液:称取磷酸氢二钠(Na2HPO4?12H2O)45.23克,柠檬酸(C6H8O7?H2O)8.068克,加水溶解,稀释至1000毫升。 标准比色液:称取氯化钴(CoCL2?6H2O)25克和重铬酸钾3.34克溶于100毫升0.01N HCL,其五倍稀释作标准。 样品:细菌-淀粉酶2.器材 电热恒温水浴 试管 量筒 吸量管(1ml) 3.操作方法: 1)取试管1支,加20毫升2%淀粉,混匀,在30水浴中,使管内温度达到30。 2)将淀粉酶0.5ml加到30的淀粉液中,混匀,在30水浴中保温,自加入记时,经5 分钟后取反应液1毫升,加入盛有5毫升稀碘液的试管中。混匀,目测比色,每隔一定时间重复测定,直至呈色与标准比色颜色相同为止,记录反应进行的时间。 3)计算。在上述条件下,每一小时催化1毫升2%可溶性淀粉水解的酶量,定为一个酶活力单位。 (7)纯化并保存 菌种保存时一般都需要不受杂菌污染,菌种变异很少,并能尽量保持细菌的形态和生理性状不发生变化。同时,做好以下工作: 做好菌
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