第六章 酶学分析技术.ppt

第五章酶学分析技术 退出 主要内容 六 工具酶及其临床应用 一 酶的一般特征 二 酶促反应动力学 三 酶活性浓度测定技术 四 酶的免疫化学测定 五 同工酶和亚型的测定 七 血清酶 八 临床常用血清酶及其同工酶 一 基本概念 第一节酶的一般特征 三 酶的命名分类及编号 二 酶的结构与催化作用 返回章 1 酶 核酶 2 酶的催化特性 极高的催化效率 高度的特异性 催化作用的可调节性 3 酶促反应 酶所催化的反应 酶活性 酶催化反应的能力 酶活性单位 在一定条件下使酶促反达到某一速度时所需要的酶量 底物 S 酶所作用的物质 产物 P 酶促反应的生成物 酶的激活剂 加速酶促反应的物质 酶的抑制剂 减慢或终止酶促反应的物质 一 基本概念 返回节 酶活性单位惯用单位惯用单位是酶活性测定方法的建立者所规定的单位 由于单位定义不同 参考范围差别很大 难以进行比较 国际单位 IU 在特定的条件下 每分钟转化1 mol底物的酶量为一个国际单位 以IU表示 1IU 1 mol min 1 Katal单位在规定条件下 每秒钟转化1mol底物的酶量为1kat 1kat 1mol s 1 常用单位为 katal或nkatal Kat与IU的换算关系为 1IU 1 mol min 1 16 67nmol s 1 16 67nkatal 四 酶活性浓度的单位 返回节 二 酶的结构与催化作用 单纯酶和结合酶单纯酶 只含多肽链 是单纯蛋白质 结合酶 由酶蛋白和辅因子组成 两者结合后形成的复合物称为全酶 与酶蛋白结合疏松的称为辅酶 与酶蛋白结合牢固的称为辅基 酶的活性中心酶与底物结合并将底物转变成产物发生在酶表面的一个特定区域 酶的催化作用机制诱导契合学说 返回节 三 酶的命名 分类及编号 返回节 参考范围与正常上限升高倍数 ULN 由于临床实验室进行酶学测定时所选仪器 试剂和方法不同 加之生物学变异等对酶活性影响 常常导致实验室之间所得参考范围差别甚远 应根据各自情况对各种酶建立自己的参考值 所谓正常上限升高倍数 ULN 是指用测得的酶活性结果除以参考范围上限 便于比较来自不同方法的结果 如将ULN进一步适当分级 更制定出轻度 中度及极度增加的范围 一目了然 有些酶测定要考虑到不同性别 年龄时间时 用ULN换算更能正确表达 就不致发生误判 返回节 一 米 曼氏方程 酶促反应动力学 三 酶促反应进程曲线 四 影响酶促反应的因素 二 Km与Vmax 返回章 Michaelis和Menten提出的酶作用的中间产物学说 一 米 曼氏方程 E S K1 K2 K3 返回节 1913年提出了著名的酶促反应速度与底物浓度关系的方程式 即米 曼氏方程 Michaelis Mentenequation E P ES 二 Km与Vmax Km值 等于酶促反应的初速率为最大速率Vmax一半时的底物浓度 即V Vmax时 则Km S Km在临床上的应用 反映酶与底物的亲合力 且与亲合力成反比 用来计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于最大反应速度的百分率 根据Km值选择酶的最适底物 确定工具酶用量 确定代谢酶系中的限速反应和作为鉴别酶的依据 Vmax 酶完全被底物饱和时的反应速度 代表了在一定酶量下的最大反应速率 返回节 三 酶促反应进程曲线 如将酶反应过程中测得的产物 P 或底物 S 变化量对时间作图 可得酶促反应时间进程曲线 图中产物 P 或底物 S 变化曲线的斜率就代表酶促反应的速率 延滞期 线性反应期 底物耗尽期 必须根据线性反应期的反应速率才能准确计算出酶活性浓度 返回节 四 影响酶促反应的因素 1 底物浓度2 酶浓度3 温度4 pH5 抑制剂6 激活剂7 辅因子针对酶学检验 返回节 不同贮存温度时体液酶的稳定性 酶不耐融化 与同工酶类型有关 标本未酸化 标本加枸橼酸或醋酸至pH5 酶活性浓度测定就是要使酶促反应的初速度 v 达到最大速度Vmax 即在过量底物存在下的零级反应期的速度 此时反应速度与酶浓度 E 之间存在线性关系 第二节酶活性浓度测定技术 一 酶活性浓度测定方法 二 酶偶联法 三 血清酶活性浓度测定条件的选择 四 酶活性浓度的单位 五 系数K值的计算与应用 六 临床酶学测定的标准化 返回章 1 按反应时间分类 定时法连续监测法2 按检测方法分类 量气法 分光光度法 荧光法其它方法 放射性核素法 离子选择电极法 旋光法 极谱法 HPLC或生物发光法等 一 酶活性浓度测定方法 返回节 按检测方法分类 底物或产物浓度的检测 返回节 定时法 固定时间法 测定酶与底物作用反应一定时间后底物或产物变化的总量 计算酶促反应平均速度 优点 比较简单 最后测定时因酶促反应已被终止 故所用仪器无需恒温装置 显色剂的选择也可不考虑对酶活性的影响 缺点 无法知道在整个酶促反应进程中是否都处于线性期 利用该法测定酶活性浓度 必须保证酶和底物在所选定的温度下作用时间要非常精确 否则会引起较大误差 返回节 连续监测法又称速率法或动力学法 指在酶促反应过程中用仪器监测某一反应产物或底物的浓度随时间的变化量 求出酶反应初速度 间接计算酶活性浓度的方法 优点 无须终止酶促反应 不需添加其它成色试剂 就反应物变化的多点测定结果连接成线 观察到整个反应过程 选择线性反应期来计算酶活性 结果准确可靠 要求检测仪器具有恒温装置及自动检测功能 自动生化分析仪都能达到这些要求 返回节 连续监测法的种类 直接法是指待测酶酶促反应的底物或产物有特征性的理化性质 然后通过特殊的仪器直接检测 基于NADH或NADPH的反应原理 LD HBD等基于人工合成色素原底物 ALP GGT AMS等基于氧的消耗 各种氧化酶间接法是指酶促反应底物和产物之间没有特征性的理化性质 需通过另一个化学反应或生化反应 将底物或产物转化为有明显特征理化性质的另一个化合物 用直接法来测定的酶类非常有限 很多情况下不得不使用间接法 一步间接法酶偶联法 返回节 酶活性浓度单位临床上酶活性浓度采用每单位体积 升 所含的酶活性单位数表示 酶活性浓度单位的计算连续监测法根据摩尔消光系数进行酶活性浓度的计算 公式如下 返回节 用自动生化分析仪测定同一酶 条件固定时 从理论上来讲V v和L均为固定值 为常数 则将公式简化为如LD活性浓度 已知NADH的 为6 22 103 cm 1 mol 1 血清量为50 l 底物液为1ml 比色杯光径为1cm 则K 1 05 106 6 22 103 0 05 1 3376 系数K值的计算与应用 返回节 连续监测法中常数K值的设置测定酶的判断值或参考范围上限 保证测定的可靠 所以转氨酶的常数K一般在3000左右 不少人宁愿在1500左右 应考虑到测定时间 测定时间短到0 5分 此时0 001嗓音对每分钟 A误差将是0 002 反之 测定时间延长到2分钟 误差也小一半 即测定时间长 则K值可以设置大一些 如测定时间只有0 5分钟 K值一般不超过4000 改变K值最方便的途径就是改变标本稀释度 稀释倍数愈大 K值愈大 返回节 连续监测法中常数K值的检验摩尔吸光系数 对一定物质而言常是一个定值 但在一些外界条件影响下也会有所变化 对硝基酚 当pH 10时 405nm处其 为18500 NAD P H 当波长大于334nm时 随温度升高 同一波长的 值会轻度下降 值在近似单色光的光源条件下才能成立 实际K值的测定 一些性质稳定的物质如对硝基酚 用高纯试剂配成标准品或直接购买 计算出实际K值 NAD P H反应有关酶测定的K值 葡萄糖终点法测定 产生与葡萄糖相等摩尔数的NAD P H 返回节 临床常用血清酶的测定方法与参考范围 37 国际临床化学联合会 IFCC 参考方法 实际为拟胆碱酯酶 PChE 返回节 第六节同工酶及亚型的测定 一 同工酶的概念及分类 二 同工酶的分析方法 返回章 概念 同工酶是催化相同的化学反应 而酶蛋白的分子结构 理化性质不同的一组酶 亚型指基因在编码过程中由于翻译后修饰的差异形成的多种形式的一类酶 往往在基因编码产物从细胞内释入血浆时因肽酶作用降解而形成 分类 简单分类 原级同工酶和次级同工酶 基因分类 单基因决定的同工酶 复等位基因同工酶 多基因决定的同工酶和修饰的同工酶等四类 一 同工酶的概念及分类 返回节 二 同工酶的分析方法 返回节 电泳法 电泳材料 醋酸纤维素薄膜 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 等电聚焦及毛细管电泳等 区带显色 各同工酶区带进行酶促反应显色后 扫描定量 而颜色的深浅与同工酶活性成正比 巨分子酶产生的原因 酶与免疫球蛋白形成复合物 如CK BB IgG 酶与其他蛋白质形成复合物 如LD 脂蛋白 酶亚基或分子之间形成聚合物 如CK Mt聚合物 LD亚基自身聚合等 返回节 层析法 利用同工酶分子量大小 所带电荷多少的不同 以及受某些离子交换剂吸附的强弱程度不同来进行分离鉴定的方法 柱层析 如离子交换层析和亲和层析等 因操作方法费时繁琐 一般不用于临床同工酶常规检测 而主要用于同工酶的分离 制备 纯化 层析法 返回节 免疫抑制法根据同工酶的某一种亚基与相应的抗体结合后 酶活性受到抑制 可算出该型同工酶的活性 如CK MB活性测定 免疫沉淀法该法利用同工酶抗体形成抗原抗体复合物沉淀的原理 减去法可算出同工酶的活性 其他免疫学方法测定酶蛋白利用酶是蛋白类抗原但含量极微的特点 可应用免疫电泳 RIA EIA和CLIA等方法 这类方法的最大特点就是与酶活性无关 测定酶的质量 免疫分析法 返回节 底物特异性分析法利用不同的同工酶对底物的亲和力的差异即可进行分析 抑制剂分析法利用同工酶之间结构的不同而对同一种抑制剂有不同的亲和性和反应性来进行分析 pH分析法利用不同的同工酶可有不同的最适pH进行分析 热失活分析法利用不同同工酶的耐热性不同来进行分析与鉴定 动力学分析法 返回节 第七节工具酶及其临床应用 一 工具酶 二 代谢物的酶法测定 返回章 概念作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性的酶称为工具酶 工具酶参与的指示反应偶联H2O2工具酶及指示反应 如常用的Trinder反应 NAD P 或NAD P H偶联的脱氢酶及其指示反应 利用氧化 还原酶反应使其连接到NAD P NAD P H的正 逆反应后 直接测定NAD P H的变化量 一 工具酶 返回节 Ex为待测酶 A为底物 B为中间产物 A B二物质的变化无法直接监测 此时可外加第二个酶Ei 为指示酶 其底物为B 反应产物为P可直接测定 二 酶偶联法 返回节 酶偶联反应最简单的模式为 辅助反应如果一些酶促反应找不到合适的指示酶与其直接偶联 此时还可在始发反应和指示反应之间加入另一种酶 将二者连在一起 此反应称为辅助反应 模式为 返回节 其中 B C均为中间产物 Ea Ei都为工具酶 最后一个酶称指示酶Ei 其他外加的酶都为辅助酶 Ea 酶偶联反应原理 1 当用酶偶联法测定时 在偶联反应中存在几个时期 预孵育期 延滞期 恒态期 非恒态期 2 延滞期是酶偶联反应与一般酶反应的一个重要区别 从酶反应开始至稳态期间 指示酶反应较慢且不稳定 称为延滞期 在这期间指示酶反应速度不能代表测定酶量多少 3 设计和选择酶偶联测定方法时 延滞期越短越好 测定时间要避开此期 返回节 酶偶联法测定ALT的吸光度变化图 返回节 对酶偶联反应的要求指示酶反应必须是一级反应酶反应速度与指示酶底物浓度相关 工具酶催化的最大反应速度必须远远大于测定酶 其所催化的反应必须在中间产物浓度很低的条件下进行 并且将此很快转变为最终产物 反应体系中不应有中间产物堆积 否则导致误差 工具酶作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性的酶称为工具酶 返回节 根据Vx Km x Vi Km i的比值来选择指示酶的用量Vi 式中Vx为测定酶的测定上限 比值为1 10 1 100 1 1000时 误差28 4 0 7 实例 在肌酸激酶测定法中 CK的Km为2 4mmol L 指示酶G 6 PD的Km为0 27mmol L 如将CK测定上限定为450U L 实际测定时标本稀释60倍 实际为7 5U L 如希望上述比例为1 100 代入上式 Vx Km x Vi Km I 1 100Vi 3 1 10 3 min 1 0 27mmol 100 8 37 10 2 mmol min 1 L 1 83 7U L如反应体系为1ml 只需0 0837U的G 6 PD即可 指示酶 辅助酶的浓度计算方法一 返回节 根据米氏方程式来计算 在酶偶联反应中 指示酶催化速度 Vi 的米氏方程式为 指示酶 辅助酶的浓度计算方法二 返回节 以天冬氨酸氨基转移酶 AST 为例希望中间产物P浓度很低 定为0 001mmol L 指示酶苹果酸脱氢酶Km为0 0165mmol L 如设定AST上限为300U L 标本为1 12稀释 实测上限为25U L 代入上式 Vi 0 0014mmolmin 1 1 4U得1 4U 如反应体系为3ml 则试剂中苹果酸脱氢酶用量为466U L 目前试剂中用量为600U L 从以上计算来看 试剂中用量是足够的 临床化学中常用的共通性呈色反应 返回节 工具酶的其他应用酶循环法固相酶 酶循环法测定胆汁酸 返回节 多酶体系中酶促偶联反应分析 酶偶联法与酶活性测定一样 直接法测定的项目是有限的 每种代谢物可以使用不同的酶而建立多种检测方法 如甘油三酯 肌酐都有多种酶试剂法 指示反应主要分两大类 NAD P H和过氧化物酶 POD 系统 代谢物的酶法测定 终点法的类型 返回节 动力学法概念 根据米氏方程 当 S Km 一般 S Km 0 2 最好 0 05 S Km Km 此时呈一级反应 反应初速度v k S 如果能准确测定反应的初速度 v 采用标准浓度对照法即可求得待测物的浓度 实际操作中 测定两个固定时间的吸光度差值 只要此期间待测物消耗 5 就可以采用标准浓度对照法计算样本浓度 所以动力学法有时又称为定时法 返回节 与终点法相比 动态法测定中待测物无需完全转化 故工具酶的用量较少 为了保证有足够的测定线性 所用酶的Km应足够大 两者对于测定仪器的要求不同 终点法测定对于仪器的电噪声和温控要求不严 而动态法要求仪器的电噪声小 吸光度应读准到0 0001 温度变化 0 1 产物的堆积和样品色原对动态法影响较小 而对终点测定法影响较大 如碰到乳糜或溶血 在做终点法测定时 有时需设样本空白 终点法与动力学法的主要区别 返回节 临床常用血清酶及其同工酶 二 谷氨酰转移酶及其同工酶 三 肌酸激酶及其同工酶 四 乳酸脱氢酶及其同工酶 五 碱性磷酸酶及其同工酶 六 酸性磷酸酶及其同工酶 七 淀粉酶及其同工酶 八 脂肪酶 九 胆碱酯酶 一 转氨酶及其同工酶 返回章 一 血清酶的来源 第七节血清酶 三 血清酶的生理变异 四 血清酶变化的病理机制 二 血清酶的去路 返回章 血浆特异酶为血浆蛋白的固有成分 在血浆中发挥特定的催化作用 多数由肝脏合成并以酶原形式分泌入 在一定条件下被激活起作用 与凝血有关的酶或酶原 ChE Cp及LPL等 非血浆特异酶外分泌酶 由外分泌腺合成并分泌进入血浆的酶 包括P AMY P LPS 前列腺ACP等 细胞内酶 存在于细胞内进行物质代谢的酶 随着细胞的不断更新或破坏可少量释入血液 当其大量出现于血清中时 提示酶的来源组织细胞受损 最常用于临床诊断 一 血清酶的来源 返回节 二 血清酶的去路 血清酶的半寿期 T1 2 定义 酶失活至原来一半时所需时间 半寿期代表酶从血中清除的快慢 半寿期长的酶 在血清中持续时间长 血清酶的失活和排泄酶的清除主要是在血管内失活或分解 血清酶经蛋白酶水解产物 多肽或氨基酸 可经小肠粘膜排至肠腔 再彻底分解成氨基酸后被重吸收 其中大部分可被组织利用 不能利用的氨基酸则随尿排出体外 返回节 三 血清酶的生理变异 1 性别少数酶如CK ALP及GGT等有性别差异 与血清酶的来源组织有关 2 年龄血清酶的活性随年龄而变化 ALP和GGT到老年时可有轻度升高 年龄差异也见于同工酶 3 进食过量饮酒可使血清GGT明显升高 4 运动多种血清酶活性升高 如CK LD AST ALD和ALT等 其升高的幅度与运动量 持续时间 运动频率及骨骼肌所含的酶量有关 5 妊娠胎盘组织可分泌一些酶进入母体血液 如耐热ALP LD LAP和ALT 少数 等 引起血清中这些酶活性升高 6 其他一些酶活性与体重 身高的增长 体位改变 昼夜变化及家庭因素有关 返回节 酶合成异常合成减少合成增多酶释放增加 大多数血清酶增高的主要原因细胞内外酶浓度差异酶蛋白分子量的大小酶的组织分布酶在细胞内定位和存在形式酶的清除异常不同疾病和不同的酶从血中清除时间和机制不同 如AMY和ALP经肾脏或胆道排出异常而致血清酶升高 返回节 四 血清酶变化的病理机制 方法条件的选择尽可能采用连续监测法 减少步骤 化学试剂有一定纯度 双蒸水 使用双试剂 测定参数的设置方法类型 波长 样品量与试剂量 稀释水量 试剂吸光度上下限 空白速率 反应孵育时间 延迟 监测时间 底物耗尽限额 线性范围及计算因子F值 标本的采集 运输与保存影响因素 溶血 抗凝剂 温度等 干扰因素的控制反应干扰 污染 底物自行发生反应 三 血清酶活性浓度测定条件的选择 返回节 一 转氨酶及其同工酶 生化特性ALT AST以磷酸吡哆醛 维生素B6 作为辅基 单纯的酶蛋白无催化活性 组织分布ALTs ALTm AST ASTm正常血清主要为ASTs 当细胞受到轻度损伤时ASTs显著升高 若血清中出现大量的ASTm 则表示细胞严重受损 返回节 转氨酶的测定方法目前 国内外实验室多采用连续监测法进行测定 返回节 ALT速率法测定中酶偶联反应式为 AST速率法测定中酶偶联反应式为 转氨酶测定的临床意义急性肝损害ALT的升高常与病情轻重相平行 可作为判断急性肝炎是否恢复的指标 常是肝坏死的前兆 心脏 骨骼肌等组织受损 肝胆疾病时血清ALT水平也可出现不同程度的升高 在AMI患者胸前区疼痛发作后6 8h 血清AST可明显升高 发病后48 60h达峰值 4 5天可降至正常 转氨酶轻度增加 1 3ULN 胰腺炎 酒精性脂肪肝 肝硬化 肉芽肿 肿瘤等 中度增加 3 10ULN 的疾病 传染性淋巴增多症 慢性活动性肝炎 肝外胆道梗塞 心肌梗死等 重度增加 20ULN 的疾病 病毒性肝炎 中毒性肝炎 返回节 二 谷氨酰转移酶及其同工酶 生化特性 GT或GGT是一种含巯基的线粒体酶 组织分布分布于肾 胰 肺 肝 肠和前列腺等多种组织中 其中以肾脏含量最多 GGT在细胞中有膜结合型 疏水型 和可溶型 亲水型 两种 血清中GGT主要来源于肝胆系统 返回节 GGT的测定方法以往国内多以L 谷氨酰 萘胺或L 谷氨酰 对硝基苯胺等人工合成底物进行比色法测定 即重氮试剂法 由于底物水溶性差 缓冲液和pH对结果影响较大 现已较少应用 目前国内外多采用连续监测法测定血清 GT活性 返回节 IFCC参考方法采用L 谷氨酰 3 羧基 对硝基苯胺 GCNA 作为底物 以甘氨酰甘氨酸 双甘肽 作为 谷氨酰基的受体 在pH7 7的条件下 GT催化底物生成 谷氨酰双甘肽和黄色的2 硝基 5 氨基苯甲酸 在410nm波长处直接连续监测 吸光度的增高速率与 GT活性成正比关系 返回节 GGT测定的临床意义 1 胆道疾病胆石症 胆道炎症 肝外梗阻等升高明显 2 肝实质疾病肝炎 脂肪肝 肝硬化时中度升高 慢性肝炎活动期GGT多增高 非活动期则多正常 原发性或转移性肝癌时不同程度的增高 3 诱导作用对乙醇性中毒的判断有一定的价值 长期接受巴比妥类药物 含雌激素的避孕药者升高 4 同工酶用醋酸纤维薄膜电泳可将GGT同工酶分为GGT1 GGT2 GGT3和GGT4四种 正常人只有GGT2和GGT3 重症肝胆疾病和肝癌时有GGT1出现 乙醇性肝坏死 胆总管结石及胰腺炎时GGT2增加 GGT4与胆红素增高相关 返回节 三 肌酸激酶及其同工酶 生化特性肌酸激酶为巯基酶 易受金属离子Ca2 Cu2 Zn2 Mn2 等的抑制 Mg2 是CK的必需激活剂 由两种不同亚基 M和B亚基 组成的二聚体 按电泳速率的快慢分为 CK BB CK1 CK MB CK2 CK MM CK3 和CK Mt CK4 四种同工酶 组织分布广泛分布于全身 骨骼肌含量最高 其次是心肌和脑组织 CK BB在脑和脊髓内含量最高称为脑型同工酶 分为氧化型 中间型和还原型3种亚型 CK MB主要存在于心肌细胞内称为心型同工酶 分为CK MB1 CK MB2亚型 骨骼肌中几乎全部为CK MM 称为肌型同工酶 分为CK MM1 CK MM2 CK MM3亚型 返回节 CK的测定方法有比色法 紫外分光光度法和荧光法等 由于以磷酸肌酸为底物的逆向反应速度快 约为正向反应速度的6倍 所以采用逆向反应进行测定较为普及 如肌酸显色法和酶偶联法 其中以后者最常用 有两种工具酶及指示酶参与反应 IFCC测定CK的参考方法为酶偶联法 返回节 CK同工酶和亚型的测定方法临床常规测定CK同工酶多用电泳和免疫抑制法 但二法均会受溶血和巨CK的干扰 免疫抑制法还会受到CK BB的干扰 现推荐用免疫化学方法直接测定CK MBmass 可不受溶血和巨CK的干扰 CK同工酶亚型 CK MM亚型和CK MB亚型 多用琼脂糖凝胶高压电泳和等电聚焦电泳等 返回节 正常和病理状况时琼脂糖凝胶电泳分析血清CK同工酶可能出现的酶带 返回节 CK及其同工酶测定的临床意义主要用于早期诊断AMI 1 血清CK总活力AMI后2 4h开始升高 10 24h达峰值 3 4天恢复正常 2 CK同工酶及亚型AMI胸痛发作后 血清CK MB的上升先于其CK总活性 CK MB CK 0 03可诊断为AMI CK MM亚型的测定 以CK MM3 CK MM1 1 0作为诊断AMI的标准 CK MB2亚型 在AMI早期诊断和判断有无再灌注上同样有很高的灵敏度和特异性 一般以CK MB2 1 9U L或CK MB2 CK MB1 1 5作为AMI的诊断标准 返回节 四 乳酸脱氢酶及其同工酶 生化特性乳酸脱氢酶是糖酵解途径中的一种重要酶 LD除催化L 乳酸外还可催化 羟丁酸 酮丁酸进行脱氢反应 组织分布LD位于细胞质中 是一种含锌的糖酵解酶 LD是由H 心型 和M型 肌型 两种不同亚基组成的四聚体 5种同工酶 若用 羟基丁酸作为底物 可测定H亚基的活性 返回节 LD的测定方法目前多用连续监测法 LD P法 以丙酮酸为底物 反应方向P L 的逆向反应 称LD P法 LD L法 以乳酸为底物 反应方向L P 的顺向反应 称LD L法 为IFCC参考方法 pH为9 4 通过在340nm波长处监测NAD 还原成NADH吸光度的增加速率而计算LD活性 返回节 LD同工酶的测定方法常用电泳法 免疫沉淀法和免疫抑制法等 目前以琼脂糖凝胶电泳法更多用 一般成年人存在如下规律 LD2 LD1 LD3 LD4 LD5 部分正常儿童血中可见LD1 LD2 返回节 LD及其同工酶测定的临床意义心肌梗死LD心肌酶中升高最晚 持续时间长 急性肝炎 慢性活动性肝炎和肝癌 尤其转移性肝癌 时 LD明显升高 LD同工酶主要用于AMI和肝病的诊断AMILD1升高最为显著 LD1 LD2 1 视为诊断AMI的一个特异指标 肝胆疾病LD5升高常表示有肝细胞坏死 肝细胞性黄疸时LD5 LD4 阻塞性黄疽时LD4 LD5 肿瘤肝癌 尤其转移癌 时可伴有LD4和LD5明显增高 白血病 胶原病时以LD3 LD4增高为主 恶性贫血LD活性极度升高 原始巨幼红细胞可产生并释放LD 伴有LD1明显升高 LD1 LD2 返回节 AMI时心肌酶时相变化 返回节 五 碱性磷酸酶及其同工酶 生化特性碱性磷酸酶是一组底物特异性较低 在碱性条件下 最适pH为10左右 能水解很多磷酸单酯化合物的酶 组织分布ALP广泛分布定位于细胞膜表面 其含量依次为肝 肾 胎盘 小肠 骨骼等 血清中的ALP主要来自肝脏和骨骼 是胆汁淤滞的酶学指标 根据ALP的来源不同可以3大类 即胎盘ALP 肠ALP和肝 骨 肾ALP同工酶 在病理时还可能出现肝ALP和胆汁ALP等 高分子ALP 以及一些和肿瘤有关的变异ALP 如Regan NagaoALP等 返回节 ALP的测定方法 1 磷酸苯二钠比色法 测定ALP水解底物产生的酚 2 连续监测法 我国及IFCC的推荐方法 返回节 ALP测定的临床意义肝胆疾病各种肝内 外胆管阻塞引起的胆汁淤积性疾病 ALP明显升高 且ALP升高与胆红素平行甲亢 恶性骨损伤 佝偻病 Pagets病 骨折 指端肥大症所致骨损伤等 均可引起ALP活性升高 尤其是骨ALP同工酶的增高妊娠后期及儿童生长期ALP增高血清ALP活性降低 主要见于呆小病 维生素C缺乏症 甲状腺功能低下 恶性贫血等 返回节 六 酸性磷酸酶及其同工酶 生化特性酸性磷酸酶是一组对底物专一性不强 在酸性条件下水解各种正磷酸单酯的酶 组织分布ACP主要存在于体内所有细胞的溶酶体中 血清中ACP主要来源于前列腺 称为前列腺ACP PAP 它可被酒石酸抑制 其活性约为其他组织中酶活性的100倍 非前列腺ACP 不被酒石酸抑制 正常男性血清中的ACP约有1 3 1 2来自前列腺 其余则与女性血中的ACP一样可能来自血小板或破骨细胞 返回节 ACP的测定方法ACP的测定底物 原理和方法与ALP相似 只是反应pH为酸性 如利用磷酸苯二钠法和磷酸对硝基酚法等在酸性条件下测定ACP 国外多推荐使用磷酸麝香草酚为底物的比色法 可通过用L 酒石酸这类抑制剂鉴别和估量PAP活性 由于ACP不稳定 酶活性测定困难 目前已发展一些免疫学方法特异而灵敏地测定ACP 特别是PAP 血标本采取后必须尽快分离血清并立即测定 不同方法参考范围也不同 返回节 ACP测定的临床意义前列腺疾病血清PAP测定是诊断前列腺癌最重要的指标之一 在前列腺肥大 前列腺炎 急性尿潴留时亦可升高 酒石酸抑制试验可区别PAP与非PAP 骨病恶性骨肿瘤 变形性骨炎 多发性骨髓瘤 骨质疏松 代谢性骨病等轻度增高 肝病肝癌 肝硬化肝炎时ACP增高 血液病溶血性疾病 白血肉 血小板疾病等 ACP均有不同程度的升高 返回节 七 淀粉酶及其同工酶 生化特性 amylase AMY或AMS 是一种不均一性的钙依赖金属蛋白酶 AMY作用的最适pH在6 5 7 5 卤素和其他阴离子有激活作用 Cl Br NO3 I 分子量40000 50000 易从肾脏排出 半寿期很短 约为2h 返回节 组织分布 AMY分为两种同工酶 S AMY和P AMY 利用醋酸纤维薄膜电泳或琼脂糖电泳可将S AMY分为S1 S2 S3和S4四个亚型 P AMY分为P1 P2 P3三个亚型 P AMY和S AMY可单独或联合与抗淀粉酶自身抗体以非共价形式结合 形成高分子循环复合物 称为巨淀粉酶 M AMY M AMY的分子量较大 不易从肾小球滤过 因此容易造成高淀粉酶血症 返回节 AMY的测定方法AMY总活性测定 化学法 酶偶联法 根据底物不同分为两类 一类是以天然淀粉为底物的测定方法 如碘淀粉比色法等 另一类底物是人工合成的麦芽多糖为底物的测定方法 这类方法是国内外目前应用最多的方法 如2 氯 对硝基苯麦芽三糖苷 CNP G3 和亚乙基封闭的对硝基苯麦芽庚糖苷 4NP G7 法 亦称EPS法 以后者最常用 EPS法测定AMY 返回节 AMY测定的临床意义AMY活性增高急