MM_FS_CNJ_0346 出口贝类腹泻性贝类毒素检验方法.DOC

MM_FS_CNJ_0346出口贝类 腹泻性贝类毒素 白鼠试验法MM_FS_CNJ_0346出口贝类腹泻性贝类毒素检验方法1.适用范围本方法适用于海产双壳类贝肉、贝柱、外套膜及其制品的腹泻性贝类毒素的检验。2.原理概要用丙酮提取贝类中毒素，再转移至乙醚中，经减压浓缩至干后，再以1吐温60生理盐水溶解残留物注射小白鼠观察存活情况，计算其毒力。3.主要试剂和仪器3.1.主要试剂丙酮（分析纯）；乙醚（分析纯）；1吐温60生理盐水。3.2.仪器旋转蒸发器；均质器；天平：感量0.1g；刻度试管：15mL，具0.2mL刻度；冰箱：05和1520；注射器：1mL；注射器针头：8#；体重为1620g的健康ICR系雄性小白鼠。4.检验批同一检验批的商品应具有相同特征，如产地、规格等。5.试样的保存5.1.样品要有充分的代表性并尽可能没有个体差异。同时，还要有充分的个数。去壳贝肉、带壳的或罐装的等，均应采取足够的个数并使贝肉达200g以上。5.2.远离实验室，不能及时送检的样品，除了在常温下品质不会发生变化的，应将样置于合成树脂袋内冷冻送检。如为带壳样品，应按6.3的方法开壳，去除水分后冷冻送检。6.试样的制备6.1.生鲜带壳样品，用刀切开闭壳肌开壳取出贝肉。不得以加热及加药物的方法开壳。注意不要破坏闭壳肌以外的组织，尤其是中肠腺（又称消化盲囊，组织呈暗绿色或褐绿色）。将去壳贝肉放在孔径约2mm的金属网上，控水5min，按6.4或6.5制备检样。6.2.冷冻的带壳样品，使其在室温下呈半冷冻状态后，以前述方法开壳取肉，这时的贝肉仍呈冷冻状态。经除去贝壳外部附着的冰片，轻轻抹去水分后，按6.4或6.5制备样品。6.3.事先已除水分的冷冻去3壳贝肉，按6.4或6.5制备样品。6.4.扇贝、贻贝、牡蛎等可以切取中肠腺的去壳贝肉，称量200g贝肉重量后仔细切取全部中肠腺，将中肠腺称重后细切混合做为检样。同时，注意不要使中肠腺内容物污染案板。6.5.对不便切取中肠腺的去壳贝肉样品，可将全部贝肉细切，混合，做为检样。6.6.为避免毒素的危害，应戴手套进行检验操作。移液管等用过的器材应在5的次氯酸钠溶液中浸泡1h以上，以使毒素分解，同样，废弃的提取液等也应以上述溶液处理。7.过程简述7.1.提取7.1.1.将检样置于均质杯内，加3倍量丙酮至少均质2min。如为小均质杯，可分两次操作。7.1.2.用布氏漏斗抽滤并收集提取液。7.1.3.对残渣以检样两倍量丙酮再抽滤两次，合并抽滤液。7.1.4.将抽提液移入旋转蒸发瓶内，减压浓缩去除丙酮直至在液体表面分离出油状物。7.1.5.将浓缩移入分液漏斗内，以100200mL乙醚和少量的水洗下粘壁部分，以不生成乳浊液的程度轻轻振荡，静置分层后去除水层。7.1.6.用相当乙醚半量的蒸馏水洗醚层两次，再将醚层移入300500mL的茄形瓶中，减压浓缩去除乙醚。7.1.7.以少量乙醚将浓缩物移入50或100mL茄形瓶中，再次减压浓缩去除乙醚。7.1.8.以1吐温60生理盐水将全部浓缩物在刻度试管中稀释到10mL。按5.4条以中肠腺做为检样的，此时1mL液量相当于预先测定的20g去壳贝肉的重量。对其他检样，此时1mL液量也相当于20g去壳贝肉的重量，以此悬浮液做为试验溶液。7.1.9.如必要时，对试验溶液可做进一步稀释，稀释前，应先以振荡器使试液成均一悬浮液，再取其部分以1吐温60生理盐水稀释成4倍或16倍的试液。7.2.小白鼠试验7.2.1.以振荡器使试液或其稀释液成为均一的悬浮液。7.2.2.分别将1mL试液注射到三只体重1620g的健康ICR系雄性小白鼠腹腔中。7.2.3.按上项方法，注射1吐温60生理盐水，做为阴性对照。7.2.4.观察自注射开始到24h后的小白鼠存活情况，求出一组三只中死亡两只以上的最小注射量。7.2.5.小白鼠注射腹泻性贝毒后的症状为运动不活泼，大多呼吸异常，致死时间长（也有24h以上的。）8.结果计算8.1.毒力的计算使体重1620g的小白鼠在24h死亡的毒力为1个小白鼠单位（MU），实际小白鼠单位的计算，按下表从一组三只中二只以上在24h内死亡的最小注射量及最大稀释倍数进行计算。8.2.注射量与毒力的关系。注射量与毒力的关系。试验液注射量检样量1)毒力mLgMUg原液1.0200.05原液0.5100.14倍稀释液1.