核黄素的测定.ppt

1 实验四 核黄素 VB2 荧光光度定量测定法 2 一 实验目的 了解荧光法测定核黄素的原理和方法学习荧光光度计的操作和使用掌握荧光定量分析工作曲线法 3 二 实验原理 核黄素在pH4 9的条件下 用440 500nm波长的光激发 核黄素可发出波长为525nm的荧光在稀溶液中 荧光强度与核黄素浓度成正比测定B2标准系列溶液的荧光强度和浓度 做标准曲线测定样品中B2的荧光强度 查标准曲线得出含量 4 三 实验物品 仪器 930型荧光光度计 分析天平样品 核黄素片试剂 核黄素标准溶液6mol L醋酸器皿 大试管 8个吸管 1ml 2ml 10ml各一支容量瓶1000ml1个 5 四 操作步骤 1 标准曲线绘制将配好的10 g ml标准核黄素溶液 按下表所示比例稀释成6个标准溶液 管号 项目 单位 ml 6 四 操作步骤 2 样品溶液的配置准确称取核黄素药片4片 溶于2000ml蒸馏水中按下表所示加入试剂单位 ml 管号 项目 7 四 操作步骤 3 上机测定选用滤光片激发光波长 用带通型400nm滤光片发射光波长 用截止型510nm滤光片选择灵敏度标准曲线的测定样品的测定 8 五 记录结果与计算 1 记录荧光强度F2 计算核黄素mg 100g F V总 100 m V用 1000 9 六 注意事项 VB2怕光 实验时应尽量避光选择合适的灵敏度值样品液测定条件与标准曲线测定条件一致比色皿是石英材质 注意不要损坏实验报告不能照抄实验指导四人作一组实验每组比色时间10min 10 七 思考题 1 荧光测定的方法有哪几种 2 荧光法测定VB2时应注意哪些问题 11 930A型荧光光度计仪器讲解 波长 330nm 700nm滤光片的种类激发滤片 范围 330nm 530nm330 360 400 500 530nm荧光滤片 420nm 650nm420 450 470 510 550 600 650滤光片的选择根据被测溶液的激发光谱和荧光光谱选择 12 930A型荧光光度计仪器讲解 使用步骤安装滤光片开机 101010参数的设置1 光闸的设置 参数1输入 关OFF 2 输入日期 参数2输入090927输入3 输入激发波长 参数3输入400输入4 输入发射波长 参数4输入510输入5 输入打印状态 参数5输入1输入ON 13 930A型荧光光度计仪器讲解 使用步骤参数的设置6 选择拟合标准曲线 参数6输入1输入1是一次2是二次3是点到点7 起始号输入 参数8输入001输入1号起8 灵敏度设置 灵敏度数值输入1 999注 最大荧光强度为999 因此最大浓度不要超过999 14 930A型荧光光度计仪器讲解 使用步骤标准曲线的测量1 按标准键放入空白0输入读取荧光光度值放入第一管02 输入显示0 2读取荧光光度值放入第二管05 输入显示0 5读取荧光光度值放入第三管10 输入显示1 0读取荧光光度值放入第四管15 输入显示1 5读取荧光光度值放入第五管20 输入显示2 0读取荧光光度值2 输入结束 再按标准键 打出拟合一次曲线 15 930A型荧光光度计仪器讲解 使用步骤样品的测量 放入被测样品测量仪器会显示出被测样品的浓度值 并打印出荧光值和浓度值记录 相应标准的荧光强度 做标准曲线图根据测量的浓度值 计算出结果 16 17 18 19 20 21 光源 22 23 24 概念 维生素是一类维持动物机体生命活动必不可少的一类低分子有机化合物维生素的种类脂溶性维生素 VitA VitD VitE等水溶性维生素 B族 VitC等 25 概念 核黄素的特点在水溶液中具有较强的荧光强度干燥或酸性溶液中稳定碱性溶液中较易破坏遇光易氧化对热稳定耐氧 26 概念 含核黄素的食物以肝 肾 心 蛋 奶含量最多其次是豆类和新鲜绿叶蔬菜B2缺乏口角炎 舌炎 皮肤炎 唇干裂等 27 概念 什么是荧光当紫外光照射某一物质时 该物质会在极短的时间内 发射出较照射光波长更长的光荧光光谱激发光 被荧光物质所吸收的照射波长的光发射光 把产生的荧光称发射光仪器部件激发光源 液槽 单色器 检测器 记录器 28 概念 定量的依据在稀溶液中 荧光强度F与物质的浓度c有以下的关系 F kI0 lCF 荧光强度k 常数 I0 激发光强度 摩尔消光系数l 溶液厚度C 溶液浓度当实验条件一定时 荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系F kC 29 概念 定量的依据对于同一物质 当激发光强度I0和溶液厚度l一定时 荧光强度和物质的浓度成正比荧光分析法的特点灵敏度高选择性好 线性范围宽所用的样量少 操作方法简便 30 概念 影响荧光的因素溶剂的影响pH温度光