生物素、亲和素标记技术.ppt

生物素 亲和素标记技术 广州医学院第一附属医院检验科廖伟娇 一 生物素及其理化性质1概念2分子式结构特点溶解特性等电点其它特性 1概念 生物素 biotin 是动 植物体内广泛分布的一种小分子生长因子 又名辅酶R或维生素H 分子式 C10H16O3N2S分子量 244 31 结构特点 咪唑酮环 四氢噻吩环结合亲和素侧链末端羧基结合蛋白质溶解特性 难溶于水 易溶于二甲基甲酰胺 DMF 等电点 PH 3 5其它特性 羧基需经活化修饰才能结合蛋白质 羧基活化的生物素 称为活化生物素 也叫生物素衍生物 生物素衍生物的种类及特性 1生物素羟丁酰亚胺酯 BNHS DMF制备 生物素 N 羟基琥珀酰亚胺二环己基碳二亚胺标记特点 BNHS中的羧基与蛋白质中的赖氨酸氨基结合达到标记的目的适用于 标记Ab 酶 中性或偏碱性Ag DNA 长臂活化生物素 BCNHS DMF 6 氨基己酸制备 生物素 N 羟基琥珀酰亚胺二环己基碳二亚胺 在BNHS的B与羧基之间插入2分子的6 氨基己酸 标记特点 同BNHS BCNHS中的羧基与蛋白质中的赖氨酸氨基结合达到标记的目的适用 同BNHS 标记Ab 酶 中性或偏碱性的Ag DNA 3生物素酰肼 BHZ 制备 生物素 水合肼标记特点 BHZ与蛋白质中的醛基结合而标记适用 标记偏酸性的蛋白质 酶 DNA 三 亲和素及其理化性质1概念2分子式结构特点溶解特性等电点其它特性 1概念 亲和素 avidin 是动物微生物中提取的一种含10 碳水化合物的碱性糖蛋白 链霉亲和素 是从链球菌属的菌培养液中提取的一种蛋白质分子量 A 6 7KDSA 6 6 5KD 3结构特点 每分子由四个亚基组成溶解特性 溶于水 C 5mg ml等电点 A PH 10 5SA PH 6 0比活性 A 12u mgPSA 14u mgP 四 亲和素的活性及其测定1亲和素的活性 是表示亲和素结合生物素的能力 即 ugB mgA或ugB mgSA 活性测定 羟基偶氮苯 2 羧酸 HABA 法 A SA HABA 红色 BA B 出现黄色时B的量 分光光度法 五 生物素标记物及亲和素标记物的制备 1生物素标记物的制备 B Ab Ag E交联剂B Ab Ag E亲和素标记物的制备 A SA Ab Ag E交联剂A SA Ab Ag E 六 技术类型 可有Ag与Ab反应的各种免疫方法 夹心法 间接法 竞争法等 在次基础上引入A B系统 BAB法 Ag B AbAg Ab BAAg Ab B AB EAg Ab B A B E特点 以游离A分别连接B Ab和B E 返回 BA法 Ag B AbAg Ab BA EAg Ab B A B E特点 以A E SA E代替BAB法中的A 省却了加B E的步骤 ABC法 A B EA B E ABC Ag B AbAg Ab BABCAg Ab B ABC特点 将BAB法中的A先与B E结合 制备成复合物ABC 返回 A A Ag Ab1 Ab2 B A EAg