生物技术课件-02基因工程常用工具酶.ppt

2基因工程常用工具酶 基因工程的重要特点之一是在体外实行DNA分子的切割和重新连接 因此 工具酶是DNA体外操作必不可少的工具 取得编码某种药物的目的基因 大多需要工具酶 限制性核酸内切酶将目的基因与载体DNA连接在一起 也需要工具酶 DNA连接酶 目前 许多厂商都在生产各种优质工具酶 简化了分子克隆操作 拓宽了基因工程的研究领域 世界大型工具酶生产厂商 1 NovoNordisk 诺和诺德公司 丹麦 2 GistBroccdes 荷兰 3 Cultot 科特公司 芬兰 4 GenencorInternational 杰能科公司 美国 5 Solvay 苏尔威公司 比利时 6 ClrHansen 汉森公司 丹麦 7 RhonePonlene 罗兰 普朗克公司 法国 8 Quest 荷兰 2 1限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶 restrictionendonucleases 简称工具酶 是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列 并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶 限制性核酸内切酶主要从原核生物中分离出来 仅II型限制型核酸内切酶已有2000多种 可以识别200多个不同的DNA序列 2 1 1限制性核酸内切酶的发现 2 1 1 1细菌的限制 修饰作用1952年 Luria和Human 1953年 Bertani和Weigle发现细菌的限制 restriction 现象 E colikPhage k E coliB E coliB限制 k 感染 不感染 噬菌体侵染细菌 仍有少量phage K 可在E coliB中生存 是因为这些phage对自身进行了修饰 大肠杆菌K 大肠杆菌B 普通的phage K 修饰的phage K 10 4 限制作用 1 1 2 1 1 2R M系统 细菌中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶 构成了寄主控制的限制 修饰系统 R MRestriction modificationsystem R M系统是细菌安内御外的积极措施 细菌R M系统的限制酶可以降解DNA 为避免自身DNA的降解 细菌可以修饰 甲基化酶 自身DNA 未被修饰的外来DNA则会被降解 个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰 则可免予被降解 2 1 1 3限制性内切酶的发现 1968Linn和Arber从E coliB中发现限制酶 1970Smith 美 在流感嗜血杆菌发现限制酶 1978W Arber H O Smith Nathans因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔奖金限制性核酸内切酶 限制酶 在细胞内能够识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列 并对DNA分子进行切割的一种酶 功能 降解不同源DNA 而不降解同源DNA 2 1 2限制性核酸内切酶的分类 根据限制性核酸内切酶的限制修饰活性 相对分子量大小 酶蛋白结构 切割位点及限制作用所需的辅助因子等 将限制性核酸内切酶分为三类 I型酶 II型酶 III型酶 2 1 2限制性核酸内切酶的分类 EcoRI Escherichia 属名 Coli 种名 Ry13 株系 编号 若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母 2 1 3限制性核酸内切酶的命名 2 1 4限制性核酸内切酶的活性单位 50 LBuffer中 含1 g底物DNA 于最适反应条件和温度下 保温1小时 能使1 gDNA完全降解所需的酶蛋白量即为一个酶单位 用U表示 buffer pH 8 0 50mmol LTris HCl10mmol LMgCl21mmol LDTT或巯基乙醇100 gBSA ml DDT 二硫苏糖醇BSA 牛血清蛋白 2 1 5限制性核酸内切酶的切割特点 在DNA分子双链的特异性识别序列部位 切割DNA分子 产生链的断裂 2个单链断裂部位在DNA分子上的分布 通常不是彼此直接相对 断裂结果形成的DNA片段 具有互补的单链延伸末端 识别序列 绝大多数的 型限制性核酸内切酶都能够识别由4 8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列 限制性核酸内切酶就是从其识别序列内切割DNA分子的 因此这些识别序列又叫核酸内切酶的切割位点或靶序列 识别序列有连续的 如GATC 和间断的 如GANTC 两种 它们都呈回文结构 ABCC B A A B C CBA A B N BA ABNB A 或 EcoR 5 GAATTC 3 3 CTTAAG 5 不同核酸内切酶的特异识别位点 AAGCTT TTCGAA A B C D DNA DNA Hind Hind 切割位点 核酸内切酶Hind 对双链DNA分子的切割作用 三种酶切末端 平齐末端 如Sma Alu Hae 5 粘性末端 如EcoR 3 粘性末端 如Pst 5 G AATTC 3 3 CTTAA G 5 同裂酶和同尾酶 同裂酶 来源不同的限制酶识别相同的核苷酸靶序列 产生同样的切割 形成同样的末端 如 Hpa 和Msp 均可切割CCGG 同尾酶 来源不同 识别的核苷酸靶序列也不相同 但切割后DNA分子产生的粘性末端相同的限制性核酸内切酶 5 GGATCC 3 3 CCTAGG 5 BamH 5 TGATCA 3 3 ACTAGT 5 Bcl 5 AGATCT 3 3 TCTAGA 5 Bgl BamH Bcl Bgl 三种酶可产生相同的5 GATC粘性末端 由这种同尾酶产生的DNA片段可因粘性末端的互补而彼此再连接起来 星活性 限制性内切酶识别特异性放宽 EcoR 在正常情况下识别GAATTC序列发生切割 但如果缓冲液中甘油浓度超过5 其识别位点发生松动 可在AATT处发生切割 EcoR 这种特殊的识别能力叫做星活性 用EcoR 表示 星活性可造成位点切割机率不等 降解不完全 影响因素 甘油浓度12 20 酶与DNA比例 离子强度 45 聚乙二醇 PEG 有机溶剂 8 二甲基亚枫 二价阳离子 12 乙醇 2 1 7限制性核酸内切酶的应用 重组DNA前的切割构建新质粒构建物理图谱DNA分子杂交用限制性内切酶消化受体DNA制备DNA探针亚克隆以用作序列分析基因定位 DNA同源性研究 2 2甲基化酶 methylase 类R M系统由限制性核酸内切酶和甲基化酶两种酶分子组成 大多数限制酶都已分离出相应的甲基化酶 甲基化酶也称修饰酶 modificationenzyme 用来修饰限制酶的识别序列 在该序列位点的胞嘧啶 C 5 氨基上加一个甲基 使得该序列可以被限制性内切酶识别而免于切割 甲基化酶分两类 维持性甲基化酶 用于在新合成的DNA链上进行甲基化的酶 甲基化位置与模板链上的相同 构建性甲基化酶 用于在非甲基化的DNA链上进行甲基化的酶 用甲基化酶进行甲基化的作用封闭DNA链中的某些识别位点 保护多余的限制性酶切位点 构建新的酶切位点 2 3DNA连接酶 ligase 能够催化DNA中相邻的3 羟基和5 磷酸基团末端之间形成3 5 磷酸二酯键的酶 T4DNA连接酶 可连接带匹配粘性末端的DNA分子 也可使平端的双链DNA分子相互连接 大肠杆菌DNA连接酶 只能连接带匹配粘末端的DNA分子 2 3 1DNA连接酶作用特点 DNA连接酶需要在一条DNA链的3 末端具有游离羟基 OH 另一条链5 末端具有磷酸基 P 时才可发挥作用 3 OH和5 P需彼此相邻 且各自位于与互补链上互补碱基配对的两个脱氧核苷酸末端 DN 连接酶不能连接单链DNA分子 只能连接双螺旋DNA分子的一部分 DNA连接酶只能封闭失去一个磷酸二酯键所出现的单链切口 nick 不能封闭失去一个或数个核苷酸所形成的缺口 gap DNA连接酶反应时需要能量 NAD 或ATP 切口 失去磷酸二酯键缺口 失去核苷酸 2 3 3基因工程常用连接酶 2 3 3 1T4噬菌体DNA连接酶由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码 分子量68KD 需ATP 可以连接互补的粘性末端 如 5 ACGOHpAATTCGT 3 T4DNA连接酶3 TGCTTAApHOGCA 5 Mg2 ATP5 ACGAATTCGT 3 3 TGCTTAAGCA 5反应系统 ATP Tris HCl MgCl2 DTE 二硫赤藓糖醇 ATP pH7 5 4 15 也可以连接两条平起末端的DNA分子 但反应速度较慢 5 CGAOHPCGTA 3 T4DNA连接酶3 GCTPHOGCAT 5 Mg2 ATP5 CGACGTA 3 3 GCTGCAT 5 可以实现分子间或分子内连接 AATTC G G CTTAA AATTC G G CTTAA 5 5 5 5 1 2 AATTC G G CTTAA AATTC G G CTTAA 5 5 AATTC G G CTTAA 5 5 a 分子间连接 b 分子内连接 1 2 AT G C T A TA G C T A T4连接酶 T4连接酶 2 3 3 2大肠杆菌DNA连接酶只催化有匹配粘性末端的DNA分子需有NAD 氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 做能源辅助因子 反应缓冲体系 Tris HCl MgCl2 EDTA DTE 二硫赤藓糖醇 NAD BSA pH8 0 4 15 2 4DNA聚合酶 DNApolymerase 定义 在DNA 或RNA 模板指导下 以4种脱氧核糖核苷酸 dNTP 为底物 在引物3 OH末端聚合DNA链的一类酶 DNA聚合酶在DNA复制时起关键作用 DNA聚合酶主要有三类 聚合酶 pol 聚合酶 pol 聚合酶 pol 其中聚合酶 参与DNA修复 聚合酶 参与DNA复制 聚合酶 是基因工程中的常用酶 DNA聚合酶 在DNA复制过程中的作用 DNA聚合酶 和 的比较 主要的DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶 全酶 Klenow片段T DNA聚合酶 T Phage感染的E coli 修饰的T DNA聚合酶 测序酶 TaqDNA聚合酶 耐热 反转录酶 2 4 1大肠杆菌DNA聚合酶I 有大肠杆菌polA基因编码的一种单链多肽蛋白质 MW 109 000D 约有1000个氨基酸 分子中含有一个双硫键 一个硫氢键 还含有锌离子 椭圆型结构 2 4 1 1DNA聚合酶I催化合成DNA互补链的条件 1 四种脱氧核苷酸dNTPs和Mg2 离子 2 带有3 OH游离基团的引物 3 单链或双链模板 DNA或RNA 2 4 1 2DNA聚合酶I具有三种酶活性 1 5 3 聚合酶活性 2 5 3 外切酶活性 3 3 5 外切外切酶活性 1 5 3 聚合酶活性 以单链DNA为模板 在DNA引物3 OH末端聚合上脱氧核苷三磷酸 2 5 3 外切酶活性以双链DNA或RNA和DNA杂交体为底物 从5 端降解双链DNA或RNA和DNA杂交体的RNA部分 只对DNA配对部分即双链的磷酸二酯键有切割作用 3 3 5 外切酶活性从3 OH端降解DNA 2 4 1 3DNA的切口平移 nicktranslation DNA聚合酶 在分子克隆中的主要用途是通过DNA切口平移 制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的DNA探针 此时 DNA聚合酶 的5 3 核酸外切酶活性和5 3 聚合酶活性同时发生 5 3 外切酶活性 5 3 聚合酶活性 未经标记的核苷酸 经标记的核苷酸 2 4 1 4DNA杂交探针的制备 5 3 3 5 5 3 3 5 a b c d e a 双链的DNA分子 b 带有3 OH末端的单链缺口 c pol 从5 P移去一个核苷酸 d pol 将32P标记的核苷酸参入取代被移去的核苷酸 e 重复 c d 的步骤 缺口沿5 3 方向移动 形成32P标记的核苷酸合成的DNA链 探针 probe 探针 用来探知被测物存在的小DNA或RNA叫做探针 标记物 探针上结合有易被检测的化合物称为标记物 分子杂交 探针DNA或RNA与被测物的互补结合叫做分子杂交 molecularhybridization 2 4 2Klenow 来源 E coliDNAPolymerase 经蛋白酶水解的大片段 Klenow和Henningseon 1970 DNApol 枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶 C端 76kd N端 36kd Klenow5 3 聚合3 5 外切 5 3 外切 Klenow 用途填补限制酶的5 粘性末端为平齐末端3 末端标记Klenow在无底物时只进行3 5 外切 有底物存在时则聚合 可用 32P dNTP对3 凹端进行标记 在cDNA克隆中 合成cDNA第二条链应用Sanger双脱氧法进行DNA测序 5 CC3 GGAATT 5 CCTTAA3 3 GGAATT5 Klenow 2 4 3TaqDNA聚合酶 Thermusaqraticus 来源 从耐热细胞中纯化 已有基因工程酶多种结构 单亚基MW 94000d 活性 聚合最适温度为75 80 不具3 5 外切酶活性 具5 3 外切活性 用途 PCR反应 测序 高温下进行DNA合成可减少模板二级结构 2 4 7反转录酶 reversetranscriptase 定义 以RNA为模板合成DNA的DNA聚合酶 用途 1 逆转录 2 对RNA D