聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理 步骤 详细.ppt

李莉 聚丙烯酰胺凝胶电泳PolyacrylamideGelElectrophoresis PAGE 上海交通大学医学院 小结 1 掌握 不连续 PAGE的原理2 掌握影响PAGE迁移率的因素3 掌握PAGE的操作注意点 试剂作用4 熟悉PAG的聚合 上海交通大学医学院 思考题 名词解释1 凝胶总浓度2 交联度问答题1 与CAME相比 PAGE有哪些特点 2 试比较CAME与PAGE操作的区别 3 简述不连续PAGE的原理 上海交通大学医学院 讲课内容 上海交通大学医学院 一 PAG的组成 PAG是由丙烯酰胺 acrylamide Acr 单体和N N 亚甲双丙烯酰胺 N N N N methylenebisacrylamide Bis 交联剂通过自由基 freeradicals 聚合而成的一种多孔三维网状结构 Acr Bis porousmatrix 上海交通大学医学院 1 丙烯酰胺 acrylamide Acr 结构式 上海交通大学医学院 2 亚甲双丙烯酰胺 N N N N methylenebisacrylamide Bis 上海交通大学医学院 上海交通大学医学院 讲课内容 上海交通大学医学院 二 PAG的聚合polymerizationofPAG 需要催化剂 catalyzer 氧化还原系统作用 使Acr单体带有游离基 Freeradicals 从而与Bis进行聚合 上海交通大学医学院 一 化学聚合 AP TEMED系统 过硫酸胺 NH4 2S2O8 Ammoniumpersulfate AP 作为催化剂 四甲基乙二胺 N N N N tetramethylethylenediamine TEMED 为加速剂 上海交通大学医学院 AP在水溶液中能产生游离基SO42 使丙烯酰胺单体的双键打开 活化形成自由基丙烯酰胺 然后游离Acr和Bis作用就能聚合形成凝胶TEMED的游离碱基能促进AP形成SO42 注意 TEMED量多少都会影响催化作用 须在碱性条件下聚合 分子氧存在 聚合不完全 须去除分子氧 隔绝氧 升高温度能提高聚合 降低温度能延迟聚合 上海交通大学医学院 二 光聚合 核黄素 TEMED系统 有痕迹氧存在下 核黄素 riboflavin 在光照下 可见光或紫外光 分解 其黄素部分被还原成无色型 但在有氧条件下无色型又被氧化成带有游离基的黄素 其也能使Acr和Bis聚合形成凝胶 注意 分离胶的合成一般采用化学聚合 因为若用光聚合 凝胶的孔径受光照强度与时间的影响 导致孔径大小不同 从而影响蛋白质的分离 上海交通大学医学院 讲课内容 上海交通大学医学院 三 PAG的浓度与孔径的关系 theinitialconcentrationsofacrylamideandBIScontrolthehardnessanddegreeofcrosslinkingofthegel PAG孔径的大小主要由Acr和Bis这两种物质的浓度决定 可以根据要分离物质分子的大小 选择合适的单体浓度 Acr Bis 20 40完全透明且有弹性 10很脆 易碎 不透明 100糊状不成形 易破碎 上海交通大学医学院 凝胶总浓度T 100ml凝胶溶液中含有Acr和Bis的总克数 T a b m 100 T越大 凝胶孔径越小 适用于分离分子量较小的物质 T越小 凝胶孔径越大 适用于分离分子量较大的物质 上海交通大学医学院 交联度C Bis占单体与交联剂总量的百分比 C b a b 100 当T固定时 Bis浓度在5 时孔径最小 上海交通大学医学院 讲课内容 上海交通大学医学院 四 不连续PAGE DiscontinuousPAGE 按具体操作分垂直板形电泳圆盘电泳 按凝胶系统的均匀性分continuousPAGEdiscontinuousPAGE 上海交通大学医学院 Schematicofdiscontinouselectrophoresistechnique 上海交通大学医学院 Disc PAGE 电极槽缓冲液通常为pH8 3Tris 甘氨酸缓冲液 上海交通大学医学院 Disc PAGE 上海交通大学医学院 Disc PAGE 上海交通大学医学院 分离原理 1 浓缩效应1 凝胶层的不连续性两层凝胶T与C不同 孔径不同浓缩胶孔径大 分离胶孔径小 蛋白质在大孔径浓缩胶中移动 受阻力小 移动速度快 上海交通大学医学院 2 缓冲液离子成分的不连续性甘氨酸 pI 6 0 在pH8 3带负电 朝正极移动 进入浓缩胶 pH6 7 甘氨酸解离度 很小 有效迁移率 M 很低 移动速度较慢 称为慢离子 HCl是强电解质 1 Cl 有效迁移率大 移动速度快 称快离子 蛋白质 pI 6 0 带负电荷 有效迁移率介于两者之间 上海交通大学医学院 pH8 3Tris Glycinebuffer 甘氨酸 HCl 蛋白质 样品胶 浓缩胶 分离胶 样品 低电导区 上海交通大学医学院 3 pH值的不连续性为了控制慢离子的解离度 从而控制其有效迁移率 必须使浓缩胶与分离胶之间pH值有所区别 上海交通大学医学院 3 分子筛效应与电荷效应进入分离胶后 Gly 成为快离子分离胶只有电荷效应和分子筛效应 根据各蛋白质所带电荷不同 分子大小不同而分离 上海交通大学医学院 上海交通大学医学院 上海交通大学医学院 Loadasampleintoapolyacrylamidegelelectrophoresiswell 上海交通大学医学院 上海交通大学医学院 上海交通大学医学院 讲课内容 上海交通大学医学院 五 PAGE的特点 1 具有分子筛效应 分辨率高2 样品不易扩散 用量少 灵敏度可达10 6g3 化学性质稳定 分子结构中富含酰胺基具有稳定的亲水基团4 凝胶不带电荷 消除了电渗现象5 机械强度好 有弹性 在一定浓度范围内无色透明6 网孔可调节 上海交通大学医学院 小结 1 掌握 不连续 PAGE的原理2 掌握影