植物组织培养及人工育种.doc

生物技术在牧草及草坪草中的应用研究进展何 玮（重庆市畜牧科学研究院，重庆400039）摘要：现代生物技术在牧草及草坪植物育种工作中的运用为其打开了一个崭新的局面。组织培养和再生体系的建立为基因片段的转移和转化提供了前提条件。本文对目前遗传转化中几种较为常见的方法作了较为详细的阐述，并对其发展趋势提出了一些看法，同时，也提出了转基因植物的生物安全问题。关键词：组织培养； 遗传转化；育种Advanced in Genetic Transformation of Foragegrass and TurfgrassHe Wei(Chongqing Municipal Institute of Animal Husbandry, Chongqing 400039)Abstact: Adopting modern genetic technology will improve breeding of foragegrass and turfgrass. The tissue culture and a regeneration systen have been developed for direct DNA transfer. The research advances in genetic transformation of foragegrass and turfgrass in recent years were systematically reviewed, and introduced detail the primary methods of genetic transformation of grass. At the same time, biological safety issue with transgenic grass should also be evaluated.Key words: tissue culture; genetic transformation; breeding传统的牧草及草坪草育种基于使用自然变异，如介于生态型之间或之内，或通过有性生殖获得天然变异，但这些传统育种方法的局限性也日益明显1 。将现代遗传转化(转基因)技术融合到传统的育种手段中，有助于解决一些常规育种方法难于解决的特殊问题牧草生物技术研究始于20世纪80年代后期，因其植株再生频率低，同时应用前景不及农作物而发展滞后2。现在，人们已经认识到了生物技术在改良牧草及草坪草品种上具有的潜力。目前可形成再生植株的禾本科牧草和草坪草约有65个种，30多个属，此外对20多个种建立了遗传转化体系3。随着现代生物技术的发展，将遗传转化的转基因技术与传统育种手段相结合，不仅能够拓宽种质资源的范围，而且能更有效的利用现有的遗传变异体，为牧草及草坪植物改良和新品种选育打开了一个崭新的局面。1. 组织培养及植株再生体系的建立众所周知，植物组织培养阶段是目前大多数转基因方法所必需的，一个良好的再生体系可以极大地缩短转基因育种年限，提高育种的成功率。由于早期采用了已成熟和分化的组织作外植体，难以脱分化形成愈伤组织，使得牧草及草坪草体外培养的研究进度较慢。1.1 外植体的选择禾本科牧草的组织培养再生相对较难，主要是适用的外植体较单一4，5。Dale对一年生黑麦草未成熟胚建立植物再生的方法可谓是禾本科草较为早期的研究6。Mcdonnel和Conger，Boyd和Dale用草地早熟禾的成熟种胚作外植体，得到了愈伤组织和再生苗，但分化率很低7，8。Van der Valk等曾报道了草地早熟禾成熟胚及幼穗的组织培养结果，认为幼穗是草地早熟禾诱导胚性愈伤组织的最好外植体，并利用幼穗愈伤组织建立了悬浮细胞系，分离培养原生质体并得到了白化苗和分化的根9。而对这方面的研究，国内起步较晚，报道也少。朱根发、余毓君用幼穗、胚轴作外植体，研究了早熟禾的组织培养特性，得出了幼穗是最佳外植体的结论10。余桂红等的研究表明，高羊茅茎段和花序出愈率和愈伤组织分化率较低，幼穗和未成熟胚出愈率和愈伤组织的分化率较高，但取材受到时空的限制，而成熟种子可以作为诱导愈伤组织的理想材料11。外植体取材部位不同，其诱导产生胚性愈伤组织以及再生的能力也有所差别，因而，未成熟胚也常用于多年生黑麦草12(Lolium perenne L)和狗牙根13，14(Cynodon dactylon Var)胚性愈伤组织的诱导；叶片基部的切片用于鸭茅15(Dactylis glomerata L.)、高羊茅16(Festuca arundinacea Schreb)和多花黑麦草17(Lmuhiflorum Lam)胚性愈伤组织的诱导。以上结果表明，愈伤组织的诱导率和外植体的选择密切相关。但这些外植体（幼胚、幼穗、花药、原生质体、悬浮细胞等）或取材困难，或受季节限制不能周年供应。近年来研究者们探索了以盾片、胚轴等为外植体诱导再生植株的途径10，但植株再生频率低，还需进一步优化完善离体培养条件。1.2 培养基的化学组成对组织培养及植株再生的影响1.2.1 植物激素培养基的化学组成对禾本科草愈伤组织的形成，细胞培养和植物再生至关重要。一般高盐的MS培养基常用于草坪草愈伤组织的培养，高浓度的2，4-D或Dicamba和低浓度的细胞分裂素(如6一BA，激动素)共同存在，促进愈伤组织的启动11。朱根发等的研究表明，草地早熟禾幼穗培养的适宜2，4-D浓度在1 mgL-1以下，培养基中添加1.5 mgL-1生物素或将KH2PO4浓度提高到400 mgL-1，可能对胚性愈伤组织的诱导及筛选有一定的作用10。王铖等的试验结果发现2，4-D是影响高羊茅种子愈伤组织诱导的关键因素，而高羊茅种子愈伤组织的诱导只有在适宜的激素和环境条件的共同作用下，才能具有较高的诱导率和较好的形态结构18。刘文真等对多年生黑麦草组培的研究结果表明，在愈伤诱导培养基中加入dicamba比加入2，4-D的效果要好，这一结果和Griffin等及玄松南等对草地早熟禾的研究报道相一致19。Brosema等报道多年生黑麦草在高浓度2，4-D的作用下形成很少的胚性愈伤，甚至不形成愈伤20。1.2.2 蛋白水解物许多学者在研究中发现，在培养基中加入蛋白水解物有利于促进胚性愈伤组织的启动。Shetty等在对一些重要的禾本科植物的研究中发现，脯氨酸和谷氨酰胺有利于组织培养中胚性愈伤组织的发生21。而吴关庭等的试验表明，酪蛋白水解物、脯氨酸和肌醇等有机物可促进未成熟胚的愈伤组织诱导，但对成熟种子愈伤组织诱导及这两种外植体来源的愈伤组织的再生没有作用或产生不利影响22。但Artunduaga等认为水解酪蛋白可以改善愈伤组织的质量和提高再生率23。刘文真等对黑麦草的组培试验表明高质量浓度的氨基酸添加物与对照相比并没有改善植株的再生率19。因此，正确合理的使用这些氨基酸添加物还需进一步研究。1.2.3 碳水化合物除了在培养基中加入适量的植物激素和蛋白化合物对胚性愈伤组织的形成和植株再生有一定的影响以外，加入适当的碳水化合物，也会影响胚性愈伤组织的发生和植株再生。在谷类植物的组织培养中显示，以麦芽糖为C源效果要好于蔗糖24。但Zaghmout发现在紫羊茅愈伤组织长期培养和悬浮培养中，随着蔗糖浓度的增加（至6.2%），植株再生能力增强，白化苗数量下降，同时在不含激素的1/2MS和B5继代培养基中，加入高浓度的蔗糖有利于获得再生植株25。1992年，Dalton等也表明在培养基中加入凝胶和碳水化合物，能明显提高多花黑麦草胚性愈伤组织的形成26。在国内，张万军等（2003）在试验中发现，蔗糖在黑麦草的分化中起着重要的调节作用，低于3的蔗糖不利于黑麦草的分化27。胡张华等（2003）在对狗芽根的组织培养中发现，在继代培养基中提高蔗糖和琼脂浓度，有助于改善愈伤组织状态，促进胚性愈伤组织的发生与植株再生28。刘文真等的实验也表明蔗糖的使用提高了多年生黑麦草的再生频率19。以上结果表明，禾本科草不同于禾谷类作物，碳水化合物添加物以蔗糖为主，同时，高浓度的蔗糖有利于提高再生频率和促进胚性愈伤组织的发生。2. 原生质体的制备及植株再生在遗传转化中，首先诱导和分离胚性愈伤组织，然后建立胚性悬浮培养物，再从胚性悬浮培养物中分离原生质体进行转化试验。虽说胚性愈伤组织已直接作为结缕草遗传转化的目标材料，但是原生质体是以往成功的转化试验中采用最多的材料29。因此，原生质体作为基因转化的主要受体，它的制备和培养也是相当重要的。首先，将诱导生成的胚性愈伤组织转入液体培养基，小心地分散，在摇床上振荡培养，即可获得快速生长的悬浮细胞。然后，利用水解细胞壁的水解酶类，可以除去悬浮细胞的细胞壁，获得原生质体。一般来说，制备感受态的原生质体需选用来自于胚性愈伤组织、分散好、处于对数生长期的悬浮细胞，因为它们是牧草中提供具有细胞全能性的原生质体的唯一来源30。原生质体培养与细胞培养类同，主要差别是原生质体除去了细胞壁，需要一定浓度的渗透压稳定剂来保持原生质体的稳定，一般用加以改良的细胞培养基，如：加入L一脯氨酸和渗透物质如甘露醇、PEG一6000等，有利于维持原生质体的形态。培养基除了提供必需的营养元素外，生长调节剂、渗透压和培养基对细胞数的比率以及其他环境因素均影响原生质体的植板率(plating efficiency)和再生6。有关从细胞悬浮液分离出原生质体的报道，最早是在多年生黑麦草上31。悬浮细胞培养和原生质体培养不仅仅在黑麦草和高羊茅上进行，在别的草上也有相关报道，如鸭茅、巴哈雀稗、匍匐翦股颖、草地早熟禾、日本结缕草等。植物原生质体在合适的培养条件下，可以再生细胞壁，进行细胞分裂，形成细胞团及愈伤组织，进而并通过不同的形态发生途径再生形成完整的植株。由原生质体培养获得再生植株最早是Dalton（1988）在高羊茅上进行研究的32。Takamizo等（1990）改进了原生质体的培养系统，高羊茅植株再生频率从9.6%提高到了40-70%33。Wang等1993年利用草地羊茅原生质体获得了可育的再生植株，再生频率为20-30%34。对于多年生黑麦草，其细胞悬浮液产生的原生质体培养，首先由Dalton（1988）进行报道的32；而其产生再生植株的实验是由Creemers等于1989年进行的35。3. 遗传转化的常用途径：有4种转基因方法用于遗传转化：原生质体DNA吸收(DNA uptake by protoplast)、微粒子轰炸 (particle bombardment，Biolistic)、碳化硅介导的DNA发送(silicon carbide fiber-mediated DNA delivery)和农杆菌介导的转化(Agrobacterlummediated transformation)。 3.1原生质体DNA吸收将DNA直接发送到原生质体获得转基因植物是牧草及草坪草成功转化的主要方法之一。这种方法的原理是：原生质体能从周围介质中高效吸收质体DNA，在培养物中加PEG(聚乙烯乙二醇)或采用电穿孔（电击法）(electroporation)技术促进原生质体吸收外源DNA；利用PEG或电击法或两种方法联合使用，可使吸收率大大提高，这样就能获得更为适合的原生质体植物的再生系统，同时，可以得到大量转基因的克隆体，这些克隆体在大多数情况下，都能发育成可育的转基因植物36。在多数情况下，由原生质体转移得到的转基因植物在一定染色体位点上，优先表现出外来基因的稳定遗传性37。在牧草中，Horn等第一个报道了从原生质体获得转基因植物鸭茅38。INOKUMA（1998）等利用原生质体吸收法将潮霉素磷酸转移酶(hpt)基因导人日本结缕草并获得转基因植株39。虽说原生质体介导的转化已在许多牧草及草坪草中获得了成功，但是，通过原生质体再生植株仍然很困难，在直接向原生质体转基因的基础上，两种质体联合转化产生可识别和不能识别基因的几率很高40，并且不育的问题、多拷贝基因的整合以及转基因的重排、原生质体培养过程中严重的细胞遗传方面的干扰导致的体细胞无性系变异，仍然限制这一方法的应用。同时针对原生质体转基因牧草及草坪草的遗传细节研究，以及关于相应的外源DNA在减数分裂时的稳定性，到目前为止还不是很清楚，只有知道了一些相关的特征，直接向原生质体转移基因的技术方法才能成为研究瞬时基因表达的有利工具。3.2 微粒子轰炸（基因枪转化） 所谓基因枪转化就是通过高速飞行的金属颗粒将包被其外的目的基因直接导入到受体细胞内，对抗生素（潮霉素）和遗传因子产生抗性的基因被选做选择标记，并由此产生了严密的选择系统，从而实现基因转化的方法。Klein 等早在1987年发现，可以利用钨粒子将携带标识基因的DNA导入葱属植物的表皮细胞，并在碰撞中产生瞬时基因表达42。在20世纪80年代末期，美国康奈尔大学的Sanford教授最先提出这一方法，该方法主要是为了克服以往各种基因转化技术的局限，如农杆菌转化的宿主限制、PEG法或电击法转化所必需的繁杂的原生质体培养工作，因而在转基因研究中得到了极广泛的应用41。目前，微粒子轰炸技术已成功应用于许多禾本科草的遗传转化中。1995年，Spangenberg等人首先用基因枪转化法得到黑麦草转基因植株43。随后，AHN等利用基因枪法获得了日本结缕草转基因植株44。在国内，霍秀文等（2004）以幼穗为外植体建立了冰草组织培养再生体系，并将除草剂抗性基因bar用PDS 1000He基因枪导入了在内蒙古地区有一定面积并具推广前景的优良牧草蒙农杂种冰草，获得了转基因植株，初步建立了冰草遗传转化体系，遗传转化率为1.12。虽然认为微粒子轰炸适合于每一个物种，但其也有类似于原生质体DNA吸收法的缺点，由于外源基因整合的复杂性，获得稳定遗传的转基因植株也有较大的困难41。3.3碳化硅介质传递（碳硅纤维漩涡介导法）质体DNA能通过碳化硅介质传递到完整的悬浮培养细胞上，悬浮培养细胞与DNA和针状的碳硅纤维混合在一起，使碳硅纤维和悬浮细胞发生碰撞，并导致细胞的渗漏、DNA的吸收和植物细胞稳定转移45。这样，从这个转移细胞中，转基因植物得以修复46。Asano等在1991年，研究了Agrostis alba L.接触悬浮细胞的碳化硅介质转移GUS基因后瞬时表达特性的研究，当悬浮细胞在指数生长阶段进行转基因，GUS基因表达中心的数目最高，当复制时被传染，GUS表达水平是较高的47。Dalton等在1998年利用碳化硅介质转移技术，获得了几株转基因植物多花黑麦草和一株单基因型的多年生黑麦草50。利用目前的原始技术，对大量细胞进行修饰的结果及其限制性因素表明：以碳化硅为介质的转移方法或许不如微粒子轰炸转移技术理想和廉价。但是，通过Agrobacterium为介质的转基因技术，在大米、玉米、小麦、豆类作物上成功的获得了转基因再生幼苗49,51,52，这为挖掘在培养牧草、草坪草转基因植物的潜力做出了贡献。3.4 农杆菌介导的转化与上述三种方法相比，农杆菌作为一种天然的植物基因转化系统，具有转化的外源DNA结构完整、转化机理清楚，整合位点较稳定、拷贝数低、整合后的外源基因结构变异较小等优点，因而倍受重视。农杆菌转化植物的研究始于20世纪80年代初，自Robert创建了叶盘法以后，在双子叶植物中得到了广泛应用41。农杆菌介导的遗传转化主要的两个关键影响因素：转化受体(愈伤组织)与农杆菌的互作状态。一般采用农杆菌介导感染10 rain进行转化。愈伤组织的不同生长状态对转化频率有直接的影响，具备强分裂能力的感受态细胞是转化的基本条件48。遗憾的是，单子叶植物不属于农杆菌固有的寄主范围但是，自从1994年日本在水稻上证实农杆菌技术可行以来49，农杆菌技术在重要的单子叶植物，如水稻、玉米和大麦上的应用快速发展。同时，令人可喜的是， IANG等首次利用农杆菌介导转化方法感染日本结缕草愈伤组织，获得转基因植物，愈伤组织Gus显色可达到60%。最近，郭振飞和卢少云也试探用农杆菌介导法开展结缕草转基因研究并获得初步结果48。这些都为该技术在牧草及草坪草上的应用提供了进一步的参考。4.存在的问题及发展前景人们已经认识到了生物技术在改良牧草及草坪草品种上具有的潜力。虽然在近期的育种工作中，很多牧草和草坪草植物得以改良，然而在改良特异品质方面的进展却十分缓慢。目前，在草地的生产与运用中仍然存在许多问题，如：如何运用分子标记技术进行选择；如何根据转基因技术将单个的有价值的基因进行转移，从而评价其可能的生产潜力；怎样产生新的遗传变异和新的有用的品质，从而更好的应用先进的育种技术改良植物的品质。同时，转基因草类的生物安全性也是一个值得关注的问题。可以这样说，生物技术是一把双刃剑。随着现代生物技术的发展，必将有越来越多的转基因草类问世，给我们的经济建设和人类生活带来极大的益处。参考文献1 Van Wijk AJP, Boonman JG, Rumball W. 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